AD转基因小鼠的鉴定

1、转基因小鼠的鉴定、 剪鼠尾1. 剪鼠尾的时间 当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠 尾较好，此时鼠尾剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。2. 分辨小鼠的年龄a当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生; b当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生23 天; c当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生 34天；d当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生 10天左右；e当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生 12天左右；f当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14天左右。3. 剪鼠尾后对小鼠的标记 ：打耳孔法二、从鼠尾中提取DNA采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒（康为世纪：CW2094）

2、提取DNA，操作如 下：1. 剪取小鼠长度为的尾巴，放入灭菌后的离心管中，加入180卩L Buffer GTT震荡混匀。2. 加入20卩L proteinase ,涡旋震荡，彻底混匀。3. 置于56C水浴，直到组织溶液完全清澈，一般需消化6-8h,赋予过程中涡旋 震荡，使样品均匀分离。1） 如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质，必要时过夜消化再加入20 d protei nase K消化，不会影响后续操作。2）如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入 4浓度为100mg/d的 RNase A溶液，震荡混匀，室温放置 5-10min。4.14000rpm离心1min，以消除未消化的类似于鼠毛等组织

3、，将上清转移到一个新的灭过菌的离心管中。5. 加入200 ilBuffer GL ,涡旋震荡，充分混匀，加入 200 d无水乙醇，涡旋振荡，充分混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。1）加入 Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。2）如果多个样品一起操作， Buffer GL 和无水乙醇可以等比例混匀后一起 加入样品。3）加入 Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀， 不会影响后续操作。6. 将步骤 5 中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中， 若以此不能 加完溶液，可分多次转入。lOOOOrpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将 吸附柱重新放回收集管中

4、。7. 向吸附柱中加入500 pl Buffer GW1 （使用前检查是否已加无水乙醇）,10000 rpm离心1mi n,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。8. 向吸附柱中加入 500 pl Buffer GW2 （使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm离心1mi n，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。如需 进一步提高 DNA 纯度，可重复步骤 8。9.12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以 彻底晾干。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续 的酶促反应（酶切，PCR等）。10.将吸附柱置于一个

5、新的灭过菌的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200 p Buffer GE 或灭菌水，室温放置 2-5min，10000rpm 离心 1min,收 集DNA溶液，-20 C保存DNA。1） 如果下游实验对PH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱，洗脱液的PH 值对洗脱效率有很大影响，若用水作洗脱液应保证其 PH 值在直接， PH 值 低于时洗脱效率不高。2）离心前室温孵育 5min 可增加产量。3）用另外的50-200 p L Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。4）如果需要提高 DNA 的终浓度，可以将步骤 10所得的 DNA 洗脱液重新 加至吸附膜上，重复步骤10;若洗

6、脱体积小于200pL，可以增加DNA的 终浓度，但可能会减少总产量。三、PCRPCR程序设定：1=94.0Tfor 5:002=94.0Tfor 1:003=59.0Tfor 0:504=72.0Tfor 1:005=Goto 22times6=94Tfor0:507=58Tfor 0:508= 72T for 1:009= Goto 62times10=94.0Tfor 0:5011=56.0Tfor 0:5012=72.0Tfor 1:0013= GotolO 32times14= 72OC for 10:0015= 4.0C for 5:0016= END 目前实验室的双转基因小鼠 AD

7、 体系采用：PCR反应的体系（12 pl）: APPPrimer APP-1pPrimer APP-2plddH2O2plmix（ CW0682）6plDNA1 plPCR反应的体系（12 p）: PS1Primer PS1-1plPrimer PS1-2pl内参 -11 pl内参-21plmix（ CW0682） 6plDNA1 pl先在的EP管中加入总的体系再平均分装入各个 PCR管中（一般多加两小管 的量），将移液器调到总量的1/3到1/2体积在EP管中缓慢抽吸若干次（尽量避 免产生气泡）以便Taq酶混合均匀，最后再在各 PCR管中依次加入DNA样品。引物处理方法： 引物在安基生物有限公司合成后， EP 管上会有标记，一般为 x nmol,使用前先用12000rpm离心1min,加入10x pddH2O，涡旋振动混匀， 微型离心机离心，即可得到100 的母液，取10 p的母液，用ddH2O稀释10 倍，即加入90 p，混匀后即可得到10側 的引物工作液。四、 电泳1配胶：鉴定用的胶板有大、 中、小3种，分别用的梳子为 50、25、11齿。 分别用的*TBE的量为90ml、45ml、25ml。用的琼脂糖凝胶。2. 点样：12 p的DNA，Marker加5P。点样时注意逐个点样，不要点错， 最好把