切片标本的制作

1、切片标本的制作 本次实验采用的是石蜡切片法。 石蜡切片法的程序如下： 取材 固定冲洗（洗涤） 脱水透明包埋切片贴片烘片脱蜡 复水染色脱水透明 封藏。 上述每个程序的要求和方法可归纳为透蜡制片和染色两大步骤，现简单介 绍如下： 脱水步骤为： 将组织块浸入系列酒精 70%80%95%100%100% 各 30min。脱水的实 际时间长短视组织块的大小而定，但不宜过长。 透明步骤为： 将组织块浸入二甲苯与无水乙醇（ 1：1）的混合液 30min 二甲苯 30min 二甲苯 30min。 透蜡步骤为： 将组织块浸入二甲苯与石蜡（ 1： 1）的混合液 30min石蜡 30min石蜡 30min。 脱蜡程

2、序为： 纯二甲苯（脱蜡） 15min纯二甲苯 15min二甲苯： 纯乙醇（ 1： 1）3min 复水程序为： 纯乙醇 3min95%乙醇 3min90%乙醇 3min80%乙醇 3min70%乙醇 3min 60%乙醇 3min 50%乙醇 3min 30%乙醇 3min 蒸馏水 H、E染色程序为： 1/ 7 将已复水的切片放入苏木精染液中（ 30分钟以上），水洗 2 分钟，在 05%的盐酸水中分色 3 秒（当在显微镜下检查时，核褪至淡红色，细胞质 及结缔组织几近无色即可）蒸馏水洗 1 分钟， 01%氨水中蓝化（ 13分钟，核呈蓝紫色），蒸馏水洗（ 1 分钟），切片 由低至高浓度的系列酒精中脱

3、水（每级 35 分钟）至 95%乙醇切片入 05%伊红中复染（ 3分钟）（伊红由 95%乙醇配制的） 95%乙醇中分色 （显微镜检查呈蓝紫色，胞质及结缔组织为粉红色） 95%乙醇轻洗（除去玻片 上多余的伊红染液。动作要迅速，否则组织上的伊红要脱下来）。 透明程序为： 将已脱水的切片依次放入纯乙醇： 二甲苯（ 1：1）二甲苯二甲苯中，每级 15 分钟。 121 透蜡制片 12 11、取材从实验罗非鱼最后一根背鳍下方用解剖刀取下 3 3 4m左m右的 新鲜肌肉块取材时要注意组织块方向与肌纤维走向要一致。同时，取材时动作 迅速，保持组织的新鲜，取材所用的解剖刀要锋利。 12 12、固定把取下的肌肉组

4、织块迅速投入已预先配制好的 Bouin,s 固定剂中 固定。固定剂中的药品可以使构成组织的蛋白质变性凝结，组织块硬化，从而 保持组织及细胞的原来形态结构。 Bouin,s 固定剂配方如下： 苦味酸饱和溶液 75ml xx25 ml 2/ 7 冰醋酸 5 ml 12 13、冲洗（洗涤）肌肉块经固定剂的处理，会在肌肉的表面或内部残留 着组织液，这些残留的药品若不除去，将会对以后的制片过程产生不良影响， 所以肌肉从固定剂中取出后，必须经流水冲洗或数次的乙醇洗涤，使得组织中 残留的固定剂全部除去为止。 12 14、脱水的目的在于去除肌肉中的水分。在石蜡制片法中所用的渗透和 包埋剂就是石蜡，由于石蜡和水

5、是不相溶的。因此为了使石蜡能很好地渗透进 肌肉组织的每个部分，就必须先把肌纤维细胞中的水分除去，在脱水时要用从 低浓度到高浓度的系列酒精逐步脱水，这样可避免肌纤维因脱水而过分地收 缩。脱水需彻底。 脱水步骤为： 将组织块浸入系列酒精 70%80%95%100%100% 各 30min。脱水的实 际时间长短视组织块的大小而定，但不宜过长。 12 15、透明肌肉组织经脱水后，石蜡也不能直接渗透进肌肉组织。此时还 必须将肌肉块中所含的乙醇除去，除去乙醇的药品必须既能很好的与乙醇相 溶，又能与石蜡相溶。经这种药品处理过的肌肉，使肌肉呈现透明状，所以称 为透明剂。因此，这种处理程序就叫透明。这里采用的透

6、明剂是二甲苯。当肌 肉组织中的乙醇被透明剂替代后，肌肉组织才能透蜡包埋。 透明步骤为： 将组织块浸入二甲苯与无水乙醇（ 1：1）的混合液 30min 二甲苯 30min 二甲苯 30min。 12 3/ 7 16、透蜡是使包埋剂透入进肌肉组织的各个部分的过程。透蜡是肌肉组 织可在切片机上制作切片的需要。石蜡在常温下呈固体状，它是具有一定的熔 点，透蜡时必须使石蜡熔化为液体状态才能使石蜡渗入肌肉组织，所以透蜡过 程必须在恒温箱中进行。 透蜡步骤为： 将组织块浸入二甲苯与石蜡（ 1： 1）的混合液 30min石蜡 30min石蜡 30min。 12 17、包埋将完成透蜡程序的肌肉组织块包埋在含有石

7、蜡的小纸盒内，便 于保存及制作薄的石蜡切片。包埋时把熔化的石蜡倒入小容器内，然后迅速夹 取肌肉组织放入小容器中，并适当调整肌肉组织块的位置和方向，待容器中的 石蜡迅速凝成蜡块。 12 18、切片肌肉组织块经上述各程序的处理后，不仅变得较硬，而且有了 石蜡的支撑，经修整后便可以放在切片机上切成极薄的石蜡切片。切片的厚度 为 8um 。 12 19、贴片把由切片机上切下的含有肌肉组织的蜡条割成小段，再将小段 蜡条安放在均匀涂过蛋白质的载玻片上，滴上蒸馏水使其在展片台上加热，在 加热过程中使蜡条适当地伸展开，以此使组织伸展平正，然后把玻片上多余的 水分去掉。 12 110、烘片把贴好蜡片的载玻片置于

8、 37的恒温箱中烘烤 24 小时以上， 使切片干燥。 122 染色 4/ 7 以下各步骤均需在染色缸中进行，所以需预先准备好一套清洁的染色缸， 分别贴上系列标签并加入相应的药品。 12 21、脱蜡通过切片、贴片及烘片后，肌肉组织仍埋藏在蜡中，为了使肌 肉组织顺利染上色，必须先将肌肉组织切片上的蜡去掉，因此要把贴片烘干后 的的玻片放入含有二甲苯的染色缸内，使蜡溶解在二甲苯中。 脱蜡程序为： 纯二甲苯（脱蜡） 15min纯二甲苯 15min二甲苯： 纯乙醇（ 1： 1）3min 12 22、复水在肌肉组织透蜡包埋前已把肌肉组织中的水去除干净了，而没 有经过复水处理的肌肉组织切片不能放入水溶性的染料

9、中染色，所以染色前肌 肉组织切片中必须经复水处理，也就是使得肌肉组织中含有水分。肌肉组织切 片复水过程必须逐渐进行，即从纯乙醇 经下降的各浓度系列酒精直至水， 每级 35分钟。在水中的放置时间要稍加长，大约 10 分钟以上，苏木精染液才 能上色。 复水程序为： 纯乙醇 3min95%乙醇 3min90%乙醇 3min80%乙醇 3min70%乙醇 3min 60%乙醇 3min 50%乙醇 3min 30%乙醇 3min 蒸馏水 12 23、染色组织或细胞的许多结构在自然状态下是无色或具有很淡的颜色 的，要区分出组织和细胞的各种结构是极为困难的，为了更好地对组织的各种 结构进行观察，必须染色。

10、染色时将切片放入预先制好的染色剂内，根据不同 的目的、不同的染色剂的要求染色一定时间后取出切片，切片再行水洗、分色 或复染等程序的处理。本实验的染色采用苏木精（ hematoxylin）、伊红 （ eosin）染色法，简称为 H、E 染色法。 5/ 7 苏木精是一种碱性染料，组织或细胞中由酸性物质构成的结构，如细胞核 中的核酸等可被它染成蓝紫色。组织或细胞中可被碱性染料着色的结构或成分 称为嗜碱性。根据配制方法的不同，苏木精可配成多种 苏木精染料。伊红是一种酸性染料，细胞中由碱性物质构成的结构可被染 成红色或粉红色（如细胞质），这种结构或成分称为嗜酸性物质。 H、E染色程序为： 将已复水的切片

11、放入苏木精染液中（ 30分钟以上），水洗 2 分钟，在 05%的盐酸水中分色 3 秒（当在显微镜下检查时，核褪至淡红色，细胞质 及结缔组织几近无色即可）蒸馏水洗 1 分钟， 01%氨水中蓝化（ 13分钟，核呈蓝紫色），蒸馏水洗（ 1 分钟），切片 由低至高浓度的系列酒精中脱水（每级 35 分钟）至 95%乙醇切片入 05%伊红中复染（ 3分钟）（伊红由 95%乙醇配制的） 95%乙醇中分色 （显微镜检查呈蓝紫色，胞质及结缔组织为粉红色） 95%乙醇轻洗（除去玻片 上多余的伊红染液。动作要迅速，否则组织上的伊红要脱下来）。 12 24、脱水为了长久保存切片，已染色的切片必须脱水才能封藏。所以切 片再入纯乙醇中脱水两次。 脱水程序为： 纯乙醇 纯乙醇 12 25、透明为了更有利于对组织和细胞的内部结构进行观察分析，还必须 对组织切