发酵技术菌种选育、保藏和培养

1、发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 （一）细菌（bacteria） 醋杆菌属（Acetobacter） 乳杆菌属（Lactobacillus） 芽孢杆菌属（Bacillus） 短杆菌属（Brevibacterium） 棒杆菌属（Corynebacterium） 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 1.酵母属（Saccharomyces） 啤酒酵母（Saccharomyces ce

2、revisiae） 2. 假丝酵母属（Candida） 产朊假丝酵母（Candida utilis） 3. 毕赤酵母属（Pichia） 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 酵母的菌落酵母的菌落 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 霉菌的菌落 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 最大的经济价值在于产生多种抗生素(antibiotic) (1)放线菌的形态放线菌的形态 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏

3、和培养 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 从菌种保藏机构直接购买所需从菌种保藏机构直接购买所需 的菌株的菌株 从自然界或现有菌种中分离筛从自然界或现有菌种中分离筛 选菌种选菌种 从筛选出的菌种进行改良从而从筛选出的菌种进行改良从而 获得新菌种获得新菌种 国内菌种保藏机构国内菌种保藏机构 国外菌种保藏机构国外菌种保藏机构 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 菌种选育工作大幅度提高了微生物发酵菌种选育工作大幅度提高了微生物发酵 的产量，促进了微生物发酵工业的迅速的产量，促进了微生物发酵工业的迅速 发展。发展。 通过菌种选育，抗生素、氨基酸、维生通过菌种

4、选育，抗生素、氨基酸、维生 素、药用酶等产物的发酵产量提高了几素、药用酶等产物的发酵产量提高了几 十倍、几百倍、甚至几千倍。十倍、几百倍、甚至几千倍。 菌种选育在提高产品质量、增加品种、菌种选育在提高产品质量、增加品种、 改善工艺条件和产生菌的遗传学研究等改善工艺条件和产生菌的遗传学研究等 方面也发挥了重大作用。方面也发挥了重大作用。 菌种选育的目的是改良菌种的特性，使菌种选育的目的是改良菌种的特性，使 其符合工业生产的要求。其符合工业生产的要求。 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 在生产过程中，不经过人工诱变在生产过程中，不经过人工诱变 处理，根据菌种的自发突变而进处

5、理，根据菌种的自发突变而进 行菌种筛选的过程，叫做自然选行菌种筛选的过程，叫做自然选 育。育。 自然选育：自然选育： 从自然界分离获得菌株从自然界分离获得菌株 根据菌种的自发突变进行筛选而获得根据菌种的自发突变进行筛选而获得 菌种。菌种。 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 采样采样 增殖培养增殖培养 纯种分离及纯培养纯种分离及纯培养 生产性能测定生产性能测定 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 u定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长 培养特性。培养特性。 u采样：有针对性地采集样品。采样：有针对性地采

6、集样品。 u增殖培养：人为地通过控制养分或培养条件，使增殖培养：人为地通过控制养分或培养条件，使 所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。 u纯种分离及纯培养：利用分离技术得到纯种。纯种分离及纯培养：利用分离技术得到纯种。 u生产性能测定：进行生产性能测定。生产性能测定：进行生产性能测定。 这些特性包括形态、培养特征、营养要求、这些特性包括形态、培养特征、营养要求、 生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐 受最高温度、生长和发酵最适温度、最适受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pHpH值、值、 提取工艺等。提取工艺等

7、。 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 调查研究及查阅充分的资料调查研究及查阅充分的资料 设计实验方案设计实验方案 确定采集样品确定采集样品 的生态环境的生态环境 采样采样 确定特定的增确定特定的增 殖条件殖条件 增殖培养增殖培养 确定特殊的选确定特殊的选 择培养基及可能的择培养基及可能的 定性或半定量定性或半定量 快速检出法快速检出法 平板分离平板分离 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 原种斜面原种斜面 确定发酵培养基础条件确定发酵培养基础条件 筛选筛选 初筛（初筛（1 1株株1 1瓶）瓶） 复筛（复筛（1 1株株3 35 5瓶）瓶） 结合初步工

8、艺条件摸索结合初步工艺条件摸索 再复筛（再复筛（1 1株株3 35 5瓶）瓶） 3 35 5株株 单株纯种分离单株纯种分离 生产性能试验生产性能试验 毒性试验毒性试验 菌种鉴定菌种鉴定 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 1 1、采样地点、采样地点 以采集土壤为主。包括极端环境中的微生物类群。以采集土壤为主。包括极端环境中的微生物类群。 u一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主； 富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多， 如如 一些野果生长区和果园内。一些野

9、果生长区和果园内。 u采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 从自然界筛选从自然界筛选 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 2 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 3 3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土， 取离地面取离地面5-15cm5-15cm处的土约处的土约10g10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑，盛入清洁的牛皮纸袋或塑 料袋中，扎好，标记，记录

10、采样时间、地点、环境条件料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件 等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少 变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 样品含所需菌种较多，可直接分离样品含所需菌种较多，可直接分离; ; 样品含所需样品含所需 菌种很少，就要设法增加数量菌种很少，就要设法增加数量( (增殖或富集培养增殖或富集培养) )。 增殖培养增殖培养: : 就是给混合菌群提供一些有利于所需就是给混合菌群提供一些有利于所需 菌株生长

11、或不利于其他菌型生长的条件以促使所需菌菌株生长或不利于其他菌型生长的条件以促使所需菌 株大量繁殖，从而有利于分离它们。株大量繁殖，从而有利于分离它们。 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 增殖培养具体措施 控制培养基碳源种类 某一 特定物质为唯一碳源或氮源 控制培养条件 根据目的微生 物的特殊要求进行控制培养 高温、 高压 添加某些抑制因子或促进因子 抗真菌剂、促进因子 往往几种措施并用 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 例如： 酒精酵母含糖、酒精、低pH 纤维素酶产生菌纤维素唯一碳源 放线菌添加10%酚数滴(抑制霉菌和细菌) . . 营养和条件无

12、穷尽的组合可从自然界分离大量的特定微 生物。 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 加入抗真菌试剂（制霉菌素、两性霉素加入抗真菌试剂（制霉菌素、两性霉素B B、放线菌酮、放线菌酮、 丙酸钠以及使真菌形成较小菌落的丙酸钠以及使真菌形成较小菌落的rose bengalrose bengal等），等）， 抑制真菌生长；抑制真菌生长； 加入抗细菌抗生素（青霉素、链霉素）抑制细菌生长，加入抗细菌抗生素（青霉素、链霉素）抑制细菌生长， 增加放线菌的分出率；增加放线菌的分出率； 加入某些抗生素也可抑制部分放线菌，有利于分离到加入某些抗生素也可抑制部分放线菌，有利于分离到 一定种类的放线菌

13、。如新生霉素有利于分离北里孢菌属。一定种类的放线菌。如新生霉素有利于分离北里孢菌属。 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目） 采样（造纸厂）80度30分钟处理 文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌 0.0075%曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5 培养34天，选择有凹陷圈的

14、菌落。 从285个土样中获得62株 26株为组成型 36株为诱导型 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 A.A.增殖培养还不能得到微生物的纯种，生产菌在自增殖培养还不能得到微生物的纯种，生产菌在自 然条件下通常是与各种菌混杂在一起的，所以有必要进然条件下通常是与各种菌混杂在一起的，所以有必要进 行分离纯化，才能获得纯种。行分离纯化，才能获得纯种。 B.B.要分离纯化获得纯种要分离纯化获得纯种, ,必须将培养物制备成单孢必须将培养物制备成单孢 子或单细胞悬浮液子或单细胞悬浮液, ,经适当稀释后在琼脂平板上进行划经适当稀释后在琼脂平板上进行划 线或稀释分离才能得到纯种。线或稀

15、释分离才能得到纯种。 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 要点：要点：制备单孢子悬浮液、适当制备单孢子悬浮液、适当 稀释、选择培养基上分离稀释、选择培养基上分离 培养条件对筛选结果影响也很大，培养条件对筛选结果影响也很大， 可通过控制营养成分、可通过控制营养成分、pHpH、抑制、抑制 剂、温度和通气及热处理等来提剂、温度和通气及热处理等来提 高筛选效率。高筛选效率。 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 稀释法 是通过不断地稀释使被分离的样品分散到最低 限度，然后吸取一定量注入平板，使每一微生物都远离 其他微生物而单独生长成为菌落，从而得到纯种。稀释

16、法在培养基上分离的菌落单一均匀，获得纯种的机率大， 特别适宜于分离具有蔓延性的微生物。 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 1.稀释平皿分离法 1.稀释分离法 99ml 1g 9ml 9ml 9ml9ml9ml9ml 1/100 1/1000 10-8 10-710-610-510-4 1ml 1ml1ml1ml 1ml (1)稀 释 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养1.稀释平皿分离法 b.涂布平皿分离法 a.倾注平皿分离法 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 划线法

17、单细胞微生物(细菌、酵母菌) 是将含菌样 品在固体培养基表面作有规则的划线(有扇形划线法、 方格划线法及平行划线法等)，菌样经过多次从点到线 的稀释，最后经培养得到单菌落。划线法简单且较快。 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 2.划线分离法 a.分区划线分离法 b.连续划线分离法 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 A B C D A A B A B C 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 主要用于食用菌菌种或某些植物病 原菌的分离 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术

18、菌种选育、保藏和培养 变异是育种的基础。变异是育种的基础。 在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变 而进行菌种筛选的过程叫做自然选育而进行菌种筛选的过程叫做自然选育。 自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9 自然突变有两种情况：自然突变有两种情况： 一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和 生产质量的下降，这种突变成为负突变。 另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成 为正突变。 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 自发突变的频率较低，因此自然选育筛选自发突变的频率较低，因此自

19、然选育筛选 出来的菌种，不能满足育种工作的需要。因出来的菌种，不能满足育种工作的需要。因 而不能仅停留在而不能仅停留在“选选”种，还要进行种，还要进行“育育” 种。如通过诱变剂处理菌株，就可以大大提种。如通过诱变剂处理菌株，就可以大大提 高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选 出具有优良特性的变异菌株出具有优良特性的变异菌株诱变育种。诱变育种。 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛

20、选，称 为诱变育种为诱变育种. . 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂. . 诱变剂诱变剂 物理在：紫外，快中子物理在：紫外，快中子 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 1.出发菌株的选择： 出发菌株用来育种处理的起始菌株. .出发菌株应具备： 对诱变剂的敏感性高； 变异幅度大、产量高； 出发菌株的来源； 自然界直接分离到的野生型菌株： 生产中正在使用的菌种： 菌种保藏机构购买： 诱变育种的一般步骤诱变育种的一般步骤 计算机应用计算机应用 形态、生理生化特征形态

21、、生理生化特征 细胞壁、细胞壁、 细胞膜组成和结构等细胞膜组成和结构等 DNA，RNA等等 利用微生物利用微生物 多种不同的多种不同的 信息，包括信息，包括 表型的、基表型的、基 因型的和系因型的和系 统发育的信统发育的信 息，综合起息，综合起 来研究微生来研究微生 物分类和系物分类和系 统进化的过统进化的过 程。程。 发酵技术菌种选育、保藏和培养发酵技术菌种选育、保藏和培养 形态学特征形态学特征 生理生化特征生理生化特征 血清学试验和噬菌体分型血清学试验和噬菌体分型 特征特征分析方法分析方法观察点观察点 菌体染色反应菌体染色反应革兰氏染色法革兰氏染色法G G，紫色；，紫色；G-G-，红色，红色 菌体大小和形菌体大小和形 状状 光学显微镜，测微尺