生物化学与新生物技术

1、生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 基因组genome 基因组是生物体内全部遗传信息的集合 一个物种单倍体的一套染色体DNA 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 几个代表物种的基因组大小几个代表物种的基因组大小 物种物种基因组大小/bp基因组大小/bp T4噬菌体T4噬菌体2.0102.010 5 5 大肠杆菌(大肠杆菌(Escherichia coli) )4.2104.2106 6 酵母(酵母(Sccharomyces cerevisiae) )1.5101.5107 7 拟南芥(拟南芥(Arabidopsis thaliana) )1.0101.0

2、108 8 秀丽小杆线虫(秀丽小杆线虫(Caenorhbditis elagans) )1.0101.0108 8 果蝇(果蝇(Drosophila melanogaster) )1.65101.65108 8 水稻(水稻(Oryza sativa) )3.89103.89108 8 小白鼠(小白鼠(Mus musculus) )3.0103.0109 9 人类(人类(Homo sapiens) )3.3103.3109 9 玉米玉米(Zea mays) )5.4105.4109 9 普通小麦(普通小麦(Triticum aestivum) )1.6101.61010 10 生物化学生物化学

3、主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 基因组学genomics 发展和应用DNA制图、测序新技术以及计 算机程序，研究生命体（包括人类）全部 基因组结构及功能的学科 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 基因组学研究的最终目标基因组学研究的最终目标 u 获得生物体全部基因组序列获得生物体全部基因组序列 u 鉴定所有基因的功能鉴定所有基因的功能 u 明确基因之间的相互作用关系明确基因之间的相互作用关系 u 阐明基因组的进化规律阐明基因组的进化规律 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 人类基因组计划的科学

4、意义在于： （1）确定人类基因组中约5万个编码基因的序列及其在基 因组中的物理位置，研究基因的产物及其功能。 （2）了解转录和剪接调控元件的结构与位置，从整个基因 组结构的宏观水平上理解基因转录与转录后调节。 （3）从整体上了解染色体结构，包括各种重复序列以及非 转录“框架序列”的大小和组织，了解各种不同序列在形 成染色体结构、DNA复制、基因转录及表达调控中的影响 与作用。 （4）研究空间结构对基因调节的作用。有些基因的表达调 控序列与被调节基因从直线距离上看，似乎相距甚远，但 若从整个染色体的空间结构上看则恰恰处于最佳的调节位 置，因此，有必要从三维空间的角度来研究真核基因的表 达调控规律

5、。 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 （5）发现与DNA复制、重组等有关的序列。DNA的忠实复制保障 了遗传的稳定性，正常的重组提供了变异与进化的分子基础。局部 DNA的推迟复制、异常重组等现象则导致疾病或者胚胎不能正常发 育，因此，了解与人类DNA正常复制和重组有关的序列及其变化， 将对研究人类基因组的遗传与进化提供重要的结构上的依据。 （6）研究DNA突变、重排和染色体断裂等，了解疾病的分子机制， 包括遗传性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引发的 分子病理学改变及其进程，为这些疾病的诊断、预防和治疗提供理 论依据。 （7）确定人类基因组中转座子、逆转座子和病

6、毒残余序列，研究其 周围序列的性质。了解有关病毒基因组侵染人类基因组后的影响， 可能指导人类有效地利用病毒载体进行基因治疗。 （8）研究染色体和个体之间的多态性。这些知识可被广泛用于基因 诊断、个体识别、亲子鉴定、组织配型、发育进化等许多医疗、司 法和人类学的研究。此外，这些遗传信息还有助于研究人类历史进 程、人类在地球上的分布与迁移以及人类与其他物种之间的比较。 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 History of the Human Genome Project 1990 Official start of HGP with 3 billion $ and a 15

7、 year horizon. 1999 Sanger Centre publishes chromosome 22 2001 Draft Genome published: Celera & Public 2003 Completion (almost) of Human Genome Celera: Craig Venter Intl. Cons: Francis Collins 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 人类基因组计划HGP 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 所有的标记都必须具有多态

8、性 由于不能对人类进行“选择性”婚配，而且人类子代个体数 量有限、世代寿命较长，呈共显多态性的蛋白质数量不多， 等位基因的数量不多。 形态标记 细胞学标记 生化标记 DNA分子标记 遗传标记 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 物理图 物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以 碱基对（bp，kb，Mb）作为基本测量单位（图距）的基因 组图。 酵母第三号染色体遗传图酵母第三号染色体遗传图 （右）和物理图（左）的比较（右）和物理图（左）的比较 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 策略 用机器

9、进行自动测序，一次可读400800 个碱基，由于测定的序列长度有一定限制。 克隆重叠群法 鸟枪法 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 克隆重叠群法克隆重叠群法 v 将基因组将基因组DNADNA切割长度为切割长度为0.1Mb0.1Mb1Mb1Mb的大片段，克的大片段，克 隆到隆到YACYAC或或BACBAC载体上载体上 v 然后再进行亚克隆，分别测定单个亚克隆的序列然后再进行亚克隆，分别测定单个亚克隆的序列 v 再装配、连接成连续的再装配、连接成连续的DNADNA分子。分子。 v 这是一种自上而下（这是一种自上而下（up to downup to down）的测序策略）的测序

10、策略 v clone-by-clone methodclone-by-clone method 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 鸟枪法 将较长的基因片段打断，构建一系列的随 机亚克隆，然后测定每个亚克隆的序列， 用计算机分析以发现重叠区域，最终对大 片段的DNA定序。 生物化学（第三版）生物化学（第三版） 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 参编参编 刘文彬刘文彬 李永红李永红 姚舜姚舜 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 测序技术 Sanger双脱氧链终止法 Maxam-Gilbert化学修饰法 高通量测序技术 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊

11、张洪渊 万海清万海清 高通量高通量DNA序列分析技术序列分析技术 人类基因组计划的成功很大程度上得益于有效减少DNA测序成 本的技术更新。通过改良测序方法，不断提升其自动化程度， DNA测序的成本降低了100倍，从20世纪70-80年代$10/bp降低 到本世纪初$0.1/bp！ 如果一个熟练的DNA序列分析人员采取早期80年代方法每天测 定1000 bp计算，人类基因组（约3109bp）的全序列分析， 至少也得需要100名这样的工人花上100年的时间才能完成。而 2000年代的高通量测序仪可达到月测序1-6 Mbp！ 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 第二代测序技术 “

12、Next Generation” Roche 454：Pyrosequencing Solexa/Illumina：cyclical base addition ABI SOLiD：sequencing by ligation 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 Illumina / Solexa Genome Analyzer 2000 Mb / run Applied Biosystems ABI 3730XL 1 Mb / day Roche / 454 Genome Sequencer FLX 100 Mb / run Applied Biosystems SOLi

13、D 3000 Mb / run 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 功能基因组学功能基因组学 在完成一个生物体全部基因组测序的基础上，详尽分析基因在完成一个生物体全部基因组测序的基础上，详尽分析基因 组的序列，鉴定基因组全部基因的功能，描述各个基因的表组的序列，鉴定基因组全部基因的功能，描述各个基因的表 达和调控模式。达和调控模式。 转录组学转录组学研究某一特殊功能状态的细胞全套研究某一特殊功能状态的细胞全套RNA的类型的类型 与拷贝数；比较不同功能状态下与拷贝数；比较不同功能状态下RNA表达的变化，搜寻与功表达的变化

14、，搜寻与功 能状态变化紧密相关的重要基因群。此研究领域的常用技术能状态变化紧密相关的重要基因群。此研究领域的常用技术 是生物芯片技术。是生物芯片技术。 蛋白质组学蛋白质组学指蛋白质组研究领域，即研究某一特定状态的指蛋白质组研究领域，即研究某一特定状态的 细胞全套蛋白质表达谱。此研究领域常用技术有蛋白质双向细胞全套蛋白质表达谱。此研究领域常用技术有蛋白质双向 电泳、飞行质谱、蛋白质芯片技术等。电泳、飞行质谱、蛋白质芯片技术等。 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 转录组转录组指一个细胞内的一套指一个细胞内的一套RNA转录物，包含了某一转录物，包含了某一 环境条件、某一生命阶段

15、、某一生理或病理（功能）环境条件、某一生命阶段、某一生理或病理（功能） 状态下，生命体的细胞或组织所表达的基因种类和水状态下，生命体的细胞或组织所表达的基因种类和水 平。平。 mRNA 小小RNA：miRNA、siRNA 蛋白质组蛋白质组指一个细胞内的全套蛋白质，即研究某一特指一个细胞内的全套蛋白质，即研究某一特 定状态的细胞全套蛋白质表达谱。此研究领域常用技定状态的细胞全套蛋白质表达谱。此研究领域常用技 术有蛋白质双向电泳、飞行质谱、蛋白质芯片技术等。术有蛋白质双向电泳、飞行质谱、蛋白质芯片技术等。 与基因组不同的是，转录组、蛋白质组的定义中包含与基因组不同的是，转录组、蛋白质组的定义中包含

16、 了时间和空间的限定。了时间和空间的限定。 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 转录组学基本研究方法 Real-time PCR 基于杂交的转录组学方法 基因芯片 基于测序的转录组学方法 EST 全长cDNA文库 SAGE 第二代测序技术 生物信息学分析：基因表达聚类 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 生物芯片 在载体材料上，以大规模阵列的形式排布 了不同的蛋白质或核酸等生物分子，形成 可与目的靶分子相互作用，并进行反应的 固相表面。 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 DNA芯片 通过微阵列(Microarray)技术将高密度DN

17、A 片段阵列通过高速机器人或原位合成方式 以一定的顺序或排列方式使其附着在固相 表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基 互补杂交原理，进行大量的DNA检测 基因组芯片 表达芯片 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 芯片载体 玻璃片、硅片、尼龙膜、凝胶、金属 对载体进行化学修饰，活化试剂通过化学反应在 载体表面键合上活性基团，以便与配基结合，形 成具有生物活性的亲和表面，用于固定蛋白质和 核酸 活化试剂：EDC、NHS 活性基团：氨基、环氧化物、巯基、醛基 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 基因芯片的探针基因芯片的探针 寡核苷酸寡核苷酸Oligo cDN

18、A：PCR产物产物 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 Spotted Microarrays cDNA Arrays Oligo Arrays In Situ Oligo Synthesis Photosynthesis Planer surface Microfluidics chip E-field synthesis Integrated Chips Integrated uF, microarray and detection chips with PCR, fluorescence or e-detection Microfluidics Plastics Ce

19、ramics Silicon Other materials 不同的生物芯片技术平台不同的生物芯片技术平台 点样芯片 原位合成芯片 微流体芯片 整合型芯片 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 点样芯片点样芯片 非接触式非接触式 接触式接触式 预先合成好的探针通过预先合成好的探针通过 类似于喷墨打印机的技类似于喷墨打印机的技 术喷射到玻璃基片表面，术喷射到玻璃基片表面， 或者用针头点在片基上。或者用针头点在片基上。 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 原位合成 激光照排技术 光源 遮蔽板 芯片 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 arr

20、ay probes A 33 array CGACG ACACGAG CGAGC Nucleotide Deposition Sequence ACG A Mask 1 A A A A A 探针合成探针合成 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 array probes A 33 array CGACG ACACGAG CGAGC Nucleotide Deposition Sequence ACG C Mask 2 C C C C C C A A A A A 探针合成探针合成 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 A 33 array CGACG ACAC

21、GAG CGAGC Nucleotide Deposition Sequence ACG G Mask 3 C C C C C C A A A A A G G G G G G CGACG ACGAG CGAGC AC 探针合成探针合成 完成的芯片完成的芯片 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 L L T T L LL LL L C C L LL LL LL LL LL LL LL L A AC C T TT TT T A AC C C CC CC CC CC C G GC C C CG G A A T TA A T T C C A A T T C C A A T T C C

22、 G G A A C C G G A A A A C C T T A A C C T T A A G G C C A A G G C C T TT T O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P L L T T L LL LL L C C L LL LL LL LL LL LL LL L A AC C T TT TT T A AC C C CC CC CC CC C G GC C C CG G A A T TA A T T C C A A T T

23、C C A A T T C C G G A A C C G G A A A A C C T T A A C C T T A A G G C C A A G G C C T TT T O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P L L T T L LL LL L C C L LL LL LL LL LL LL LL L A AC C T TT TT T A AC C C CC CC CC CC C G GC C C CG G A A T TA A T

24、 T C C A A T T C C A A T T C C G G A A C C G G A A A A C C T T A A C C T T A A G G C C A A G G C C T TT T O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P O O P P For growth step: one type of monomer is coupled to specific sites deprotected using PGA. Computer

25、generated light irradiation patterns 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 样本的处理方法 按照样本分按照样本分 DNA、RNA、DNA-蛋白复合体 按照标记信号分子划分按照标记信号分子划分 荧光染料、生物素、放射性元素 按照标记方法分按照标记方法分 cDNA 直接标记(间接标记)、PCR扩增标记、末端 标记 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 芯片实验流程 1、分离RNA（10g） 2、标记 3、杂交 （预杂交） 4、洗片 5、扫描 6、数据分析 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 Tagged R

26、NA fragments flushed over array Laser activation of fluorescent tags Optical scanning of hybridization intensities 基因芯片的杂交实验基因芯片的杂交实验 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 图像扫描 Cy5 Cy3 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 差异基因筛选 原理：采用cy3/cy5的ratio值对差异基因进 行判断，或采用统计方法对差异基因进行 统计推断。 倍数法：cy3/cy5比值大于2或者小于0.5 生物化学生物化学 主编主编 张

27、洪渊张洪渊 万海清万海清 基因芯片的应用 基因表达谱分析 基因发现 SNP检测 药物基因组学 微生物菌种鉴定 预防医学研究 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 RNA-Seq 转录组测序（全转录组鸟枪法测序）：利 用深度测序技术对各种类型的转录本进行 高通量检测，获得RNA片段在特定样本中 的含量 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 定量化 可以直接测定每个转录本片段序列、单核苷酸分辨率的准确 度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉 反应和背景噪音问题 灵敏度高，可以检测细胞中少至几个拷贝的稀有转录本 可以对任意物种进行全基因组分析，无需预

28、先设计特异性探 针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行 转录组分析，同时能够检测未知基因，发现新的转录本 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 蛋白质组学 蛋白质组：一个细胞（或组织、机体）所表达的 全部蛋白质 蛋白质组学：以蛋白质组为研究对象，研究细胞 内所有蛋白质及其动态变化规律的科学 本质是在大规模水平上研究蛋白质特征： 表达水平 （量） 翻译后的修饰（成熟与调控） 蛋白与蛋白相互作用（信号通路）等 由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等 过程的整体而全面的认识 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 蛋白质组学研究范畴蛋白质组学研

29、究范畴 蛋白质和蛋白质间相互作用蛋白质和蛋白质间相互作用 蛋白质和核酸之间相互作用蛋白质和核酸之间相互作用 蛋白质及其组成质点的分离、分析、鉴定蛋白质及其组成质点的分离、分析、鉴定 蛋白质结构分析蛋白质结构分析 生理、病理或不同发育状态下蛋白质组表达差异生理、病理或不同发育状态下蛋白质组表达差异 蛋白质信息库蛋白质信息库 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 研究策略与技术 两条互补的实验流程 基于凝胶的工作流程 基于液相色谱的工作流程 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 双向电泳（2D） 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 是等电聚焦

30、电泳和SDS-PAGE的组合 即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离） 然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小） 凝胶经染色得到二维分布的蛋白质图 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 第一向IPG-IEF电泳电泳 固相pH梯度等电聚焦（immobilized pH gradients isoelectric focusing） IEF是一种根据样品的等电点不同而使它们在 pH梯度中相互分离的一种电泳技术 将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的 凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组 分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上， 形成分离的蛋白质区带 生物化学生物化学 主编

31、主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 第二向垂直SDS-PAGE电泳 SDS- PAGE：十二烷基磺酸钠-聚丙烯 酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis） 聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有浓缩效应、 电荷效应、分子筛效应 。SDS与蛋白质形成雪 茄状带负电荷复合物，从而消除了蛋白间的电 荷及形状差异，电泳速度仅与分子量有关 垂直电泳 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测 染色： 1）考马斯亮兰染色法； 2）银染法； 3）负染法； 4）荧光染色法； 5）放射性

32、同位素标记法等 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 2-DE 凝胶蛋白质斑点的分析 图像扫描和分析 全自动斑点切取系统 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测 质谱 使试样中各组分电离生成不同荷质比的离子，经加速电场的作用， 形成离子束，进入质量分析器，利用电场和磁场使发生相反的速 度色散，使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上， 不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，将它们分别聚焦而得到质 谱图，从而确定其分子量 MALDI-TOF MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱， Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of- Flight Mass Spectrometry） 样品溶于固定的底物中形成晶体，用激光脉冲使其离子化，离子 被加速后通过飞行管时分离，所有离子均可被检测 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清 蛋白质芯片 将蛋白质固定在固相载体上，通过大分子之 间的特异性识别和结合进行检测。 酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子 生物化学生物化学 主编主编 张洪渊张洪渊