1021.MTT法测定阿霉素对Hela细胞增殖的抑制效果

1、mtt法测定阿霉素对hela细胞增殖的抑制效果摘要：阿霉素为广谱抗肿瘤抗生素，对急性白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌及多种其他实体肿瘤均有效.本次实验研究不同浓度的阿霉素浓度对hela细胞增殖的抑制效果，发现随着阿霉素浓度的升高，抑制效果成对数增长。关键词：阿霉素、 mtt、 hela细胞 mtt全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。mtt比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细

2、胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色（或蓝色）结晶甲瓒（formazan）并沉积在细胞中；在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比。二甲基亚砜（dmso）能溶解细胞中的甲瓒，因此用酶联免疫检测仪在490nm或570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入mtt 不会有反应。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 mtt法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，mtt

3、 吸光度最好在0-0.7 范围内。同时，利用已知浓度细胞培养后的吸光度可以生成细胞生长趋势曲线，通过该曲线可推测出某一未知浓度细胞的原始接种浓度。1.材料与方法1.1 接种收集对数期hela细胞，调整细胞悬液浓度，使细胞浓度为23104/ml，每孔加入细胞悬液200l，使每孔内的细胞数为4000- 6000个。1.2 培养与药物处理培养箱内培养2436h，吸出培养液加入不同浓度梯度的各种抗肿瘤药物各200 l，每个浓度接种4孔作为重复实验。1.3 呈色培养箱内继续培养到第3天，于倒置显微镜下观察细胞生长情况后，每孔加5 mg/ml的mtt溶液20 l，继续孵育4 h，终止培养；快速翻转培养板，

4、弃去孔内培养上清液；然后每孔加dmso 150l，振荡30min，使结晶物充分融解。1.4 比色选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。1.5 计算与分析抑制率=(1-药物od值/对照od值)100%；抑制率30%判定药物敏感试验为阳性，反之为阴性。12. 结果与分析实验结果如表1所示，其抑制率与浓度的关系如图1所示。表1 阿霉素对hela细胞的抑制结果阿霉素浓度空白1.25ug/ml2.5ug/ml5ug/ml10ug/ml光吸收值0.455 0.445 0.354 0.254 0.195 抑制率02.20%22.20%44.18%57.14%图1 阿霉素药物浓度与

5、抑制率的关系从实验数据上我们可以看出，在浓度小于4ug/ml的时候，其药物敏感性试验为阴性，当大于4的时候，其药物敏感性试验为阳性。随着药物浓度的升高，其抑制率也成对数增长，在达到了60%左右的时候，其增长趋于平衡。即加大阿霉素浓度对其抑制率已经没有影响了。抑制率与浓度之间的趋势线满足方程y=0.2695ln（x）-0.0261。从实验结果来说，浓度未10ug/ml的阿霉素对hela细胞的抑制效果最佳。阿霉素单独用药的抑制效果在60%左右达到最高。这可能与作用的不同的癌细胞有关的。从宋海平，黄韬发表的“槐耳浸膏对乳腺癌细胞系mcf-7的体外作用研究”4一文中，了解到当阿霉素浓度达到2.6ug/

6、ml，其对乳腺癌细胞系mcf-7的抑制率已达到85%以上。阿霉素能够激活蛋白激酶c的活性，使b发生磷酸化并降解，nf-b核定位信号暴露并转人核内与靶基因的b基序结合，反而促使肿瘤细胞增殖，这可能是为什么阿霉素对某些肿瘤疗效不佳的原因之一3。 3.讨论核转录因子(nf-b)与肿瘤的发生和发展密切相关。在乳腺癌的研究中发现，阿霉素能够激活nf-b的活性而抑制肿瘤细胞的凋亡，影响其抗癌疗效2。先抑制nf-b的活性，然后使用低浓度的阿霉素，不仅能取得良好的抗癌效果，同时大大减少了阿霉素的不良反应3。所以，在往后的实验或者研究中，应该向抗癌机理或者分子水平方面重点研究。对于阿霉素的作用机理现在基本上可以

7、从资料上简单了解，但对于其与其他药物一同使用的增效现象还存在一定的未知地方。另外阿霉素免疫磁性毫微粒(aimn)已在体外复合靶向试验中获得成功。5所以，从目前来看，阿霉素用于癌细胞的抗癌治疗作用还是具有很广的前景的。本实验中，主要是对不同浓度的阿霉素对hela细胞的抗癌作用的研究，研究表明，随着阿霉素药物浓度的升高，阿霉素对hela细胞的抑制效果成对数增长，并在抑制率60%左右达到平衡。参考文献1. 魏文青,赵满仓,等. mtt肿瘤药物敏感试验的方法学研究. 临床肿瘤学杂志 2008.10 13卷,10期: 871-874.2. 宋海平，黄韬. 槐耳浸膏对乳腺癌细胞系mcf-7的体外作用研究. 华中科技大学同济医学院附属协和医院乳腺甲状腺外科中心，430022 . 1607-2286（2005）12-1789-02。3. daskc,white cw. activation of nf-kappa b by antineoplastieagents. role of protein kinase c. j biol chem，1997，272:14914-14920.4. 王剑红,黄庆科,陈民新. 抑制肝癌细胞的核