信号转导与转录激活因子3(STAT3)在锌诱导的抗心肌缺血再灌注损伤保护中的作用

1、信号转导与转录激活因子3 (STAT3在锌诱导的抗心肌缺血/再灌注损伤保护中的作用目的1.观察锌是否诱导线粒体 STAT3丝氨酸残基(Ser727)磷酸 化来改善再灌注心肌线粒体的氧化磷酸化能力以及减少再灌注期线粒体活性氧 的产生。2.探讨锌诱导线粒体STAT3丝氨酸残基磷酸化而发挥抗心肌缺血/再灌 注损伤保护作用的线粒体机制。方法建立大鼠心肌缺血/再灌注模型和心肌细胞H9c2缺氧/复氧模型。用Western blotting 实验技术检测心肌组织与心肌细胞以及线粒体p-STAT3、STAT3、p-ERK ERK Tubulin、COX IV的蛋白表达；用免疫荧光法检测 STAT3和Mitot

2、racker Red 的共定位 ; 利用高分辨率呼吸测定仪分别测定心肌组织与 H9c2心肌细胞线粒体的氧化磷酸化水平和电子传递链功能；用ATP和柠檬酸合成酶检 测试剂盒分别测定心肌组织 ATP水平和柠檬酸合成酶的活性；利用JC-1、DCFH-DA 以及Mitosox Red探针测定H9c2心肌细胞的线粒体膜电位( m及细胞内、 线粒体内ROS水平。用实时定量PCF技术(Q-PCR检测心肌组织和H9c2心肌细胞线粒体基因ND1 ND5和ND6mRNA表达水平；利用琥珀酸脱氢酶(SDH检测试剂盒检测心肌 组织和H9c2心肌细胞的琥珀酸脱氢酶活性。 结果I.Western blotting 和共聚焦

3、 显微镜的实验结果显示，常氧条件下ZnCl2诱导心肌组织和H9c2心 肌细胞STAT3第 727位点丝氨酸(Ser727)的磷酸化,并且能够促进磷 酸化的STAT3转移到线粒体内,而ZnCl2的这一作用那么被选择性锌离 子螯合剂TPEN所阻断。2.在常氧条件下,选择性锌离子螯合剂TPEN处理后使心肌组织STAT3的磷酸化水平减少,而线粒体内STAT3的磷酸化水平未发生改变,说明内源性锌离子的水平与STAT3的磷酸化有关。3.Western blotting的实验结果显示,缺血/再灌注和缺氧/复氧条件下，ZnCl2能够诱导再灌注心肌和复氧细胞的 STAT3磷酸化，并且使再灌注心肌和复氧细胞的线粒

4、体 STAT3勺磷酸化和总STAT3 含量也增加，而ZnCl2的这一作用可被选择性锌离子螯合剂 TPEN所 阻断,这些结果说明缺血再灌注条件下锌离子能够诱导心肌组织和细胞STAT3磷酸化,并使磷酸化的STAT3转移到线粒体。4.Western blotting 实验结果显示，ZnCl2能够激活ERK并且通 过ERK来诱导常氧和再灌注心肌STAT3丝氨酸残基磷酸化，而这一作用被MEK抑 制剂PD98059所阻断,说明ERK介导ZnCl2诱导的STAT3的丝氨酸残 基磷酸化。5.高分辨率呼吸测定系统(0xygraph-2K)的实验结果显 示,ZnCl2提高常氧和再灌注心肌线粒体的呼吸功能、ATP的

5、生成以及柠檬酸合成酶的活性,而ZnCl2的这一作用是通过线粒体磷酸化 STAT3来实现的。这些结果说明，ZnCl2通过线粒体磷酸化的STAT3来改善再灌注 心肌线粒体的氧化磷酸化 , 从而发挥抗缺血 /再灌注损伤的心肌保护作用。 6. 共聚 焦显微镜实验结果显示,在H9c2细胞缺氧/复氧模型中，复氧后细胞和线粒体内 的ROS水平明显增加。而ZnCl2可减少复氧后细胞和线粒体内 ROS的水平，说明ZnCl2可减少复氧时ROS的产生。进一步的实验显示,ZnCl2这一作用被STAT3突变质粒(S727A所阻断,说明线粒体 丝氨酸磷酸化的STAT3介导ZnCl2的抗氧化应激损伤的心肌保护作 用。7.

6、在缺氧 / 复氧模型 ,ZnCl2 可防止缺氧 / 复氧所引起的线粒体膜电位的降低,抑制mPT啲开放,而ZnCl2的这种保护作用被STAT3突 变质粒S727A所阻断,这说明丝氨酸残基磷酸化的 STAT3介导ZnCl2 抗缺氧/复氧损伤的心肌保护作用。8.PCR实验结果显示，ZnCl2通过 诱导STAT3丝氨酸磷酸化来增加再灌注心肌线粒体基因 ND6的mRNA表达水平， 说明ZnCl2能够防止再灌注心肌线粒体 DNA勺损伤,进而改善再灌注 心肌线粒体的氧化磷酸化能力。9.ZnCI2通过诱导STAT3的丝氨酸磷酸化来抑制H9c2心肌细胞 复氧早期线粒体琥珀酸脱氢酶SDH的活性，从而减少ROS勺产生。结论1、锌 离子通过ERK言号通路来诱导心肌STAT3的丝氨酸磷酸化,并促进磷酸化的 STAT3转移到线粒体内。2、锌离子通过线粒体磷酸化的 STAT3改善再灌注心肌线粒体的氧化磷酸化功能并抑制再灌注早期线粒体 ROS的产生。3、锌离子通过丝