激发与发射光谱

1、激发与发射光谱的含义v激发光谱激发光谱 固定发射波长固定发射波长(一般将其固定于发射波段中感兴趣的峰位),扫描出的化合物的发射光强(荧光/磷光) 与入射光波长的关系曲线 。如右图中曲线i 。v发射光谱发射光谱 固定激发波长固定激发波长(一般将其固定于激发波段中感兴趣的峰位),扫描出的化合物的发射光强(荧光/磷光) 与波长的关系曲线 。如右图中曲线i i。激发光谱与发射光谱的关系 a.stokes a.stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b. .发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能

2、级，吸收不同波长的能量(如能级图 2 , 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如 2 )。 c. . 镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状类似）成镜像对称关系。 吸收谱与激发谱v吸收谱吸收谱 化合物的吸收光强与入射光波长的关系曲线 。 吸收谱反映出的是物质的基态能级与激发态能级之间所有的允许跃迁。 通常状态下的物质的表观颜色大部分时候取决于其吸收特性v激发光谱激发光谱 固定发射波长固定发射波长(一般将其固定于发射波段中感兴趣的峰位),扫描出的化合物的发射光强(荧光/磷光) 与入射光波长的关系曲线 。 激发光谱

3、则反映的是基态与所有与该荧光发射有关的上能级之间的跃迁。其所呈现的关系比吸收谱要有选择性，但有时候有不如吸收谱来的直接。s3s0吸吸收收发发射射荧荧光光 1 0 0s2s4s5 4 3一、荧光光谱与磷光光谱v荧光光谱荧光光谱 固定激发光波长固定激发光波长(一般将其固定于激发波段中感兴趣的峰位), 物质发射的荧光强度与发射光波长关系曲线，如右图中曲线ii。荧光荧光本身则是由电子在两能级间不发生自旋反转的辐射跃迁过程中所产生的光。v磷光光谱磷光光谱 固定激发光波长固定激发光波长(一般将其固定于激发波段中感兴趣的峰位), 物质发射的磷光强度与发射光波长关系曲线，如右图中曲线iii。磷光磷光本身则是由

4、电子在两能级间发生自旋反转的辐射跃迁过程中所产生的光。s2s1s0t1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换 2t2内转换振动弛豫stokes能级图0.荧光与磷光的产生过程 由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。1. 1. 分子能级与跃迁分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态(s0)激发态(s1、s2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势； 第一、第二、电子激发单重态 s1 、s2 ； 第

5、一、第二、电子激发三重态 t1 、 t2 ；1.电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：m=2s+1 s为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态； s0t1 禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小； 2.镜像规则的解释 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似； 基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。 3.激发态基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁跃

6、迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光荧光：10-710 -9 s,第一激发单重态单重态的最低振动能级基态；磷光磷光：10-410s；第一激发三重态三重态的最低振动能级基态；4.非辐射能量传递过程 振动弛豫振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。 内转换内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态

7、的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。 外转换外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。5.辐射能量传递过程 荧光发射荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（ 多为 s1 s0跃迁），发射波长为 2的荧光； 10-710 -9 s 。 由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； 2 2 1 ； 磷光发射磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（ t1 s0跃迁）； 电子由s0进入t1的可能过

8、程：（ s0 t1禁阻跃迁） s0 激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫 t1 发光速度很慢： 10-4100 s 。 光照停止后，可持续一段时间。200260320380440500560620荧荧光光激激发发光光谱谱荧荧光光发发射射光光谱谱磷磷光光光光谱谱室室温温下下菲菲的的乙乙醇醇溶溶液液荧荧（磷磷）光光光光谱谱200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱二、荧光的产生与分子结构的关系 1. 1.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率

9、。 荧光量子产率（）：吸收的光量子数发射的光量子数 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；2.化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：* 的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。三、影响荧光强度的因素 影响荧光强度的外部因素1.1.溶剂的影响溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将

10、使化合物的荧光发生变化；2.2.温度的影响温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。3. 溶液溶液ph 对酸碱化合物，溶液ph的影响较大，需要严格控制；4.内滤光作用和自吸现象 自吸现象自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。 内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；5.溶液荧光的猝灭 碰撞猝灭； 氧的熄灭作用等。红外荧光红外荧光的特点及应用所内红外荧光领域的研究分布v近红外激光晶体1.稀土离子掺杂的激光晶体2.过渡族离子掺杂的激光晶体v红外荧光探针1.过渡金属配合物稀

11、土离子掺杂的激光晶体稀土离子能级简图荷兰的荷兰的r. t. wegh等利用德国等利用德国desy同步辐射装置对稀土离子同步辐射装置对稀土离子vuv波段的激发谱做了细致研波段的激发谱做了细致研究，并对比理论计算对究，并对比理论计算对vuv谱谱区区4f能级的预测，成功地将能级的预测，成功地将dieke图扩展到了图扩展到了70000cm-1的能的能量范围。量范围。他们选择高纯他们选择高纯liyf4作为稀土掺作为稀土掺杂的基质，因为在这种氟化物杂的基质，因为在这种氟化物晶格中，有可能与稀土离子高晶格中，有可能与稀土离子高能区的能区的4fn能级相互干扰的能级相互干扰的4fn-15d和电荷迁移态（和电荷迁

12、移态（cts）能级）能级都处于尽可能高的能区，故与都处于尽可能高的能区，故与4fn能级易于区分开来，更便于能级易于区分开来，更便于理论与实验上对能级的指认研理论与实验上对能级的指认研究。究。 扩展扩展dieke图图荧光图例nd3+nd3+yb3+yb3+er3+er3+pr3+pr3+tm3+tm3+ho3+eu3+sm3+tb3+过渡族离子掺杂的激光晶体荧光图例相关参考过渡金属配合物过渡金属配合物荧光探针过渡金属配合物的特点过渡金属配合物的特点 很多过渡族金属与配体配合时能够形成新的能级结构（homo/lumo），基态与这些能级的跃迁往往被归结为mlct或lmct。这种新的跃迁机制，较容易导

13、致量子产率相对于配体的显著增强，同时可以通过改变配位中心或配体结构在很宽的波段内调控其发射波段，所以从几十年前就开始研究了。过渡金属配合物荧光探针应用参考应用参考v在其在生命科学中的应用方面位于maryland的cfs作了诸多工作。综述综述vemerging biomedical applications of time-resolved fluorescence spectroscopy. lakowicz, j. r. (1994) in: topics in fluorescence spectroscopy, vol. 4: probe design and chemical sens

14、ing (j. r. lakowicz, ed.), plenum press, 1-19. vrecent developments in fluorescence spectroscopy (1996). lakowicz, j.r., terpetschnig, e., szmacinski, h., malak, h., kusba, j. and gryczynski, i.,. in: analytical use of fluorescent probes in oncology. (kohen, e., and hirschberg, j.g., eds.), plenum p

15、ress, new york. pp. 65-79. vlong-lifetime metal-ligand complexes as probes in biophysics and clinical chemistry (1997). terpetschnig, e., szmacinski, h., and lakowicz, j. r. in: methods in enzymology, vol. 278. academic press, pp. 295-321. vrecent developments in fluorescence spectroscopy. long-live

16、d metal-ligand probes, three-photon excitation, two-color two-photon excitation and optical control of excited state population. lakowicz, j. r., gryczynski, i., and szmacinski, h. (1998). fluorescence microscopy and fluorescent probes, vol. 2 (j. slavik, ed.), plenum press, new york, pp. 1-12.应用进展应

17、用进展vlong-lifetime lipid rhenium metal-ligand complex for probing membrane dynamics on the microsecond timescale. li, l., castellano, f. n., gryczynski, i., and lakowicz, j. r. (1999). chem. physics lipids 99:1-9. vsynthesis and characterization of a sulfhydryl-reactive rhenium metal-ligand complex.

18、dattelbaum, j. d., abugo, o. o., and lakowicz, j. r. (2000). bioconjugate chem. 11:533-536. vspectral properties of fluorophores combining the boronic acid group with electron donor or withdrawing groups. implication in the development of fluorescence probes for saccharides, n. dicesare and j. r. la

19、kowicz (2001). j. phys. chem. a., 105(28):6834-6840. 过渡金属配合物荧光探针前景前景v过渡金属配合物很多能实现较强的红外波段宽带发射，可以有效避开组织体的吸收，可以穿透组织体实现红外成像，克服同位素原子示踪对人体的伤害；v寿命处于us量级，可以用于较大分子的形变和转动扩散研究，当然，结合其特有的发射波段也能对活体环境中的许多扩散和转变过程进行研究。过渡金属配合物图例荧光探针细胞活性探针细胞活性探针v细胞活性和细胞毒性试剂盒v活细胞探针v死细胞探针v测定活细胞中巯基和谷光甘肽的探针膜荧光探针膜荧光探针v膜流动性荧光探针v荧光基团标记的磷脂v阴离

20、子型膜探针v阳离子型膜探针v中性膜探针细胞器探针细胞器探针v线粒体探针v溶酶体探针v内质问探针 v高尔基复合体探针位点特异性荧光探针位点特异性荧光探针v受体特异性荧光探针v细胞骨架探针v研究钙调节及活性的荧光探针v核酸荧光探针荧光探针胞内离子探针胞内离子探针v钙离子探针v胞内ph值荧光探针v其他离子探针电位敏感性探针电位敏感性探针v快响应探针v慢响应探针笼锁化合物探针笼锁化合物探针底物荧光探针底物荧光探针v核昔酸拟生物及寡核昔吱荧光探针vlacz基因表达的底物荧光探针vgm基因表达的底物荧光探针vluc基因表达的底物荧光探针v脱辅水母蛋白基因表达的底物荧光探针v氯霉素乙酰转移酶(cat)的底物

21、荧光探针vhiv蛋白酶的底物荧光探针 v人肾素底物荧光探针稀土元素探针v稀土离子也是一类核酸探针的检测试剂。在水溶液中仅有tb()和eu()发出荧光，与dna配合后仍保留荧光性能，可特异识别核苷酸。tb()和eu()与一些小分子配体配合，由于配体本身性质、中心离子-配体成键及溶剂等因素影响，使配合物的激发态寿命达到ms 级，并发出窄而强的荧光。tb()和eu()与小分子的配合物探针通过共价键与靶dna 共价结合后多用于实时定量荧光pcr 反应产物的分析及杂交测试。该类探针要求稀土配合物易于合成并且足够稳定，同时荧光发射强度大。nurmi 等用tb()和eu()标记的探针进行实时同步扩增及前列腺

22、特异抗原的测定，信噪比要高于传统的taqman 探针，而循环阈值则降低。量子点荧光探针v量子点荧光探针是由-族和-族元素组成的半导体纳米颗粒，将核酸连接到量子点的表面，做成探针，通过体外杂交常规荧光(fish)分析，发现染色体的异常及变异，可取代一些有机荧光染料进行生物分子检测。研究较多的有cdse、cdte、zns 等。量子点探针可以在有机溶剂中制备，但须经过一定的化学修饰，使其表面具有一定的水溶性基团，同时又具备一些与生物分子偶连的活性基团，因而反应条件苛刻，步骤复杂，成本较高。尽管在水溶液中制备的成本低，但量子点的荧光产率低，尺寸分布较大。目前较多采用在有机溶剂中合成。在强激光下易发生光

23、漂白，是有机类荧光染料最普遍的缺陷。量子点探针较传统的有机荧光染料具有一定的优越性。首先，荧光光谱范围宽，通过改变纳米晶体材料和尺寸，获得的激光诱导荧光光谱范围在400nm2m；其次，荧光光谱范围可调，稳定性好，荧光寿命长，且可用单一波长的激发光源同时激发不同大小尺寸的量子点，得到不同荧光发射波长的检测信号，相对于有机荧光染料的单一光源激发得到单一荧光发射信号，降低了实验成本并简化了分析步骤。1998年，bruchez 等44制备了cdse-zns 核-壳结构的纳米晶体，之后又增加了sio2 层，使其具有水溶性，同时sio2 经过修饰后可以与生物分子结合，量子产率高且稳定。nie 等将量子点的表面连接上巯基乙酸，使量子点不仅