气质联用技术在葡萄酒挥发性成分分析中的应用现状

1、气质联用技术在葡萄酒挥发性成分分析中的应用现状摘要：香气是评判葡萄酒品质的一个重要的感官指标，决定着葡萄酒的风味和典型性。葡萄酒的挥发性成分复杂多样，研究葡萄酒中的香气物质，对建立优质葡萄酒质量评价系统和提高其风味质量具有重要的理论与实践意义。气质联用技术的应用为葡萄酒香气物质的分析鉴定提供了强有力的手段。本文综合论述了近几年用气质联用技术分析检测葡萄酒中香气成分组成与含量的方法，并且描述和对比了各种不同的样品前处理方法。关键词：葡萄酒；挥发性成分；GC-MS；前处理Recent Progress on the Application of GC-MS in the Analysis of V

2、olatile Components in WineAbstracts: Aroma was one of the important sensory indexes to judge the quality of wine, which determined the flavor and the typical character of wine. The volatile components of wine were complex and diverse. It was of great theoretical and practical significance to study t

3、he aroma compounds in wine, and to establish the quality evaluation system and improve the flavor quality of wine. GC-MS technology application for the analysis and identification of wine aroma provided powerful means. In this paper, the composition and content of aroma components in wine were detec

4、ted by GC-MS in recent years. And described and compared a variety of different sample pretreatment methods.Key words: Wine; volatile components; GC-MS; pretreatment1 葡萄酒中的香味物质葡萄酒的整个化学成分反映了历史对酿酒的方法，用于表征和对葡萄酒的描述包括葡萄品种，生长气候，酵母菌株，用于容器发酵和储存，和酿酒实践等重要属性。葡萄酒中含有的分子组成大量的代谢物，包括初级代谢产物（如糖类、有机酸、氨基酸和生物胺）和次级代谢物（如黄

5、酮、花青素及其他色素）1。所有这些化合物强烈地影响质量酒的特性，在葡萄酒的香气和风味中起着重要的作用。葡萄酒的分子分两部分组成，一是不易挥发成分，其中包括乙醇、多酚类化合物、蛋白质和碳水化合物，和易挥发性成分，其中包括风味和香味的化合物2。到目前为止，在葡萄酒中已有1000多种挥发性化合物被检测出来，包括醇类、酯类、有机酸类、挥发性酚类、硫醇类、萜烯醇类等，它们的含量10-1-10-10g/L 不等，它们是葡萄酒香气的主要组成成分。来自葡萄浆果的香气物质造成了葡萄酒的品种特异性，它们主要来源于葡萄的果皮，以糖甙或与氨基酸键合的结构与外果皮细胞液泡结合，部分挥发性成分则以自由态存在于果皮中香气是

6、评判葡萄酒品质的一个重要的感观指标。不同葡萄酒中香气成分在的含量、比例以及平衡关系的差异性构成了葡萄酒的不同风格和地域特征3，在此基础上，GC技术逐渐发展起来。GC、GC-MS技术在葡萄酒挥发性香气成分的分析检测中也得到了广泛应用并提供了强有力的鉴定分析手段。2 气质联用技术原理GC-MS目前已经广泛用于在不同领域的研究，如微生物学4，植物生理学和医学5,6。气相色谱-质谱联用可以用于葡萄酒中较宽范围的代谢产物的定性和定量，包括有机酸，氨基酸，核酸，糖7，胺和醇等物质。气相色谱法是以气体为流动相的色谱法，为常规的分析手段。气相色谱分为流动相和固定相两相。其分离原理是利用样品中各组分在两相间分配

7、系数的差异。当两相作相对运动时，各组分经反复多次的两相间分配，使各组分得到分离。分离后的组分通过仪器配置的各种检测器（如FID、TCD、FPD等）快速检测出各种目标物质。质谱法工作原理是将气态化的物质分子裂解成离子，然后使离子按质量的大小分离，经检测和记录系统得到离子的质荷比和相对强度的谱图即质谱图。质谱图提供了有关物质的分子量、元素组成及分子结构等样品的碎片信息，从而鉴定出物质的分子结构。由此可对样品中各组分进行定性和定量分析。质谱具有灵敏度高、定性能力强的特点，而气相分离效率高、定量分析简便。气质联用既发挥了色谱法的高分离能力，又发挥了质谱法的高鉴别能力。二者功能相辅相成，分析数据的可靠性

8、极大提高，甚至能检测出气相色谱未分离的色谱峰。3 样品前处理方法葡萄酒中香气成分的测定方法有GC和GCMS方法等。葡萄酒的香味由葡萄酒中的挥发性物质所决定。这些化合物的分析根据化合物的类型和它们的浓度而选择不同的技术处理8，目前，国内外葡萄酒中香气物质的提取有多种方法，主要包括液液萃取、静态顶空、动态顶空、固相萃取、固相微萃取等。3.1 液液萃取法（Liquid-Liquid Extraction）液-液萃取法又称有机溶剂萃取法，它是在含有被分离物质（溶质）的溶液中加入与其不互溶或不完全相溶的另一种液体（萃取剂），利用溶质和杂质在两种液体之间不同的分配关系，通过相际传质实现分离。该方法可通过选

9、择不同的溶剂有针对性地提取香气成分。Caldeira M.等研究了7 种溶剂的萃取效果，结果表明，二氯甲烷萃取的化合物种类最多，而且收率较大9。A.F. Recamales利用液液萃取法研究了白酒瓶装贮藏过程中品质特性的变化，实验结果表明储存12个月后乳酸乙酯和丁二酸二乙酯含量增加，而醋酸异戊酯的含量降低10。液-液萃取对于香气成分有一定的损失，也有可能导致非原有物质的形成，萃取过程易发生乳化现象。此外，溶剂萃取得到的萃取物一般浓度很低，在进行GC-MS分析前必须进行浓缩。3.2 静态顶空法（Static Headspace Extraction）静态顶空法是将具有挥发性的样品置于紧闭系统中，

10、保持恒定温度，使其顶空的气体与样品中的组分达到相平衡，取上部的气体进行色谱分析。孔程仕11采用静态顶空技术（SHS）对赤霞珠葡萄酒酿造过程中的挥发性成分进行萃取，通过气相色谱-质谱法（GC-MS）对其进行分析。研究了不同因素（样品量、离子强度、平衡温度和平衡时间）对萃取效率的影响。静态顶空气态取样的主要优点是避免了在直接的进样测定时，复杂的样品基体成分一起被带入分析仪器系统的可能性，从而消除了自由基体成分的带入而对样品中可挥发性成分的分析所造成的影响和干扰。静态顶空主要缺点是样品的蒸汽体积过大，影响色谱柱的分离效能，特别对于组成复杂的样品，这种进样方式限制了高效毛细管柱的使用，蒸汽中大量水分也

11、往往有损柱的寿命，而且此方法对低挥发性化合物分析灵敏度较差12。3.3 动态顶空法（Dynamic Headspace）动态顶空法也称为吹扫捕集法（Purge Trap）。此法是用惰性气（如高纯度氮气）不断通过待测样品，挥发性组分随气流进入捕集器，捕集器装有固体吸附剂（现在更多使用Tenax cc），能选择性地吸附样品组分。经过一段时间驱赶，挥发性组分富集于吸附剂中，最后将它们瞬间加热而解吸，并由载气导入色谱柱进行分析。J Laaks.13利用动态顶空法控制葡萄酒挥发性成分在使用气相色谱-质谱联用分析所需的质量的控制，对196个德国红葡萄酒中22种醇类和酯类化合物进行了量化分析并利用色谱比较软

12、件建立了关于葡萄酒样品的质量控制色谱图。Ainur Utesheva14采用顶空固相微萃取结合GC-MS红葡萄酒中的挥发性成分的测定确定哈萨克斯坦红酒中的酯类、醇类、醛类、酸类化合物、酮和萘等。这种方法比静态法优越，因它不仅适用于挥发性较高的组分，而且也可用于较难挥发及浓度较低的组分。它能与毛细管色谱柱配合使用。对组分复杂含量又低的样品更为有效。缺点是容易使某些香气成分分解变化，引入外来物质。3.4 固相萃取法（Solid Phase Extraction）固相萃取（SPE）是一种试样预处理技术，由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来，一个柱色谱分离过程，分离机理、固定相和溶剂的选择等方面与

13、高效液相色谱（HPLC）有许多相似之处。固相萃取（SPE）技术基于液-固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、纯化，是一种包括液相和固相的物理萃取过程；也可以将其近似地看作一种简单的色谱过程15。B.T. Weldegergis16利用固相萃取（SPE）与GCMS技术结合鉴定出了葡萄酒及相关饮料中的214种化合物，证明了对内酯、挥发酚和萜类化合物的分析尤其有利。R. Lopez17采用混合型固相萃取方法和GC -FMS测定葡萄酒中的3 -烷基-2-甲氧基吡嗪。该方法的检测限低于1ng/L，重复性好，回收率接近100%，RSD在13%和20%之间。该方法已被应用于智利

14、的白葡萄酒和西班牙的红葡萄酒的成分分析。EG García-Carpintero18采用固相萃取（SPE）分离糖苷类化合物后用气相色谱-质谱（GC/MS）分析不同葡萄品种对葡萄酒风味的影响，研究表明摩拉维亚葡萄酒中存在一个主要的芳香族成分影响着其独特的风味。3.5 固相微萃取法（Solid Phase Microextraction）固相微萃取（SPME）是在固相萃取的基础上发展的萃取新技术，是一种全新概念的样品预处理浓缩技术。其装置简单，便于携带，易于操作，快速灵敏，选择性高，样品用量小，重现性好，精度高，检出限低，无需溶剂或仅需极少量溶剂即可完成分析19。SPME 又分浸入式固相

15、微萃取（IM-SPME）和顶空固相微萃取（HS-SPME）两种方法。目前，国内外对酒中香气的研究，大部分采用固相微萃取提取样品中的香气。Elisabete Paula Barros20利用固相微萃取（SPME）结合气相色谱-离子阱质谱（GC-IT/MS）鉴定了64个挥发性化合物，该方法可以应用于研究不同的白葡萄酒的挥发性成分。Sagratini G21用HS-SPME测定葡萄酒中的挥发性成分，用GC-MS并选择PDMS纤维分析出葡萄酒中挥发性成分有乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇、3-甲基-1-丁醇等。Burin V M22利用HS-SPME和GC-MS技术结合对29法国葡萄酒中显着不同的杂环

16、化合物的浓度进行了测定。Hjelmeland A K23采用HS-SPME对葡萄酒中的挥发性物质进行富集后用GC-MS对影响风味的甲氧基吡嗪进行检测。SPME 法能萃取到葡萄酒中更大比例的酯类物质，特别是对一些分子量较小的酯类物质和醛类物质有很好的萃取效果，与其它技术相比, 具有简便、灵敏度高、重现性及线性好、样品处理时间短, 分析样品用量少, 无需有机溶剂和绿色环保等优点24。3.6 其他前处理方法在葡萄酒香气成分的分析中，还有搅拌棒吸附萃取25（Stir Bar Sorptive Extraction，SBSE）、超声波辅助萃取26（Ultrasonic-assisted Extracti

17、on）、超临界流体萃取法27（Supercritical Fluid Extraction，SCFE）和同时蒸馏萃取28（Simultaneous Distillation Extraction，SDE）等前处理方法。4 气质联用技术在葡萄酒香气成分检测中的应用GC-MS 技术始于20世纪50代后期，随着计算机软件和电子技术的发展，此技术日益成熟，功能日趋完善，兼有色谱分离效率高、定量准确以及质谱的选择性高、鉴别能力强、提供丰富的结构信息、便于定性等特点，广泛应用于生命科学、环保、材料、食品、药物开发等领域，特别适用于易挥发或易衍生化合物的分析。自90 年代以来，GC-MS 技术在葡萄酒挥发性

18、分析中的应用越来越多，但由于前处理和色谱条件的不同，分析结果也有一定的差异。4.1 定性分析利用气相色谱对葡萄酒香气成分定性方法可分为两种，保留值对比定性和与其它仪器联用定性。通过GC-MS 得到质谱图后，可由计算机检索标准谱库对未知化合物进行定性，常用的标准谱库有NIST、Wiley/NBS。如果匹配度比较好，如90 以上（最好为100），那么可认定这个化合物就是需要的化合物，即通过已知的信息去分析未知的成分29。D Slaghenaufi30通过GC-MS技术分析显示葡萄酒和烯酮水平之间的联系，证明了烯酮是酒的风味物质的辅助物。E. Gómez 31采用GC-MS技术定性出在葡萄

19、酒发酵过程中不同阶段添加橡木片后的不同成分，并分析了橡木片对红酒的挥发性成分和感官特性的影响。目前，气相色谱法已广泛应用于葡萄酒中特征香气成分的研究32。4.2 定量分析由于GC-MS 得到的总离子流色谱图或质量色谱图的色谱峰面积与相应组分的含量成正比，可以采用色谱分析法中的归一化法、外标法、内标法等进行定量。内标法是葡萄酒挥发性成分气相色谱分析中最常用的定量方法，葡萄酒香气成分分析中主要香气成分定量常用的内标物有4-甲基-2-戊醇、2-辛醇、n-十二烷醇，微量香气成分定量常用1-庚醇、3-甲基-3-羟基-2-丁酮等作为内标；超微量香气成分的定量时常用有代表性的GC-MS 离子碎片定量。Ort

20、ega C33采用内标法成功地定量了西班牙葡萄酒中30 种香气成分，主要有乙醛、双乙酰、3-羟基丁酮以及一些葡萄酒中重要的酯类。R Perestrelo34以二乙氧基甲烷，1,1 -二乙氧基乙烷，5-甲基糠醛等为内标物分析马德拉葡萄酒的成分含量用于鉴定葡萄酒的品质及其真实性。D Slaghenaufi30对红葡萄酒和白葡萄酒首次进行了烯酮五种异构体的量化分析，结果显示红葡萄酒和白葡萄酒中烯酮的浓度范围为2-41g/l。5 展望应用GC-MS 技术分析葡萄酒中的香气成分重现性、可靠性较好，但由于葡萄酒中香气成分复杂多样，在实验操作中应根据样品情况和目标分析物选择适当的前处理方法和色谱条件，保证测

21、定结果的准确。对葡萄酒中的香气成分分析是研究葡萄酒感官指标的重要手段，但其研究价值还未完全开发出来，特别是对于微量香气成分的分析尤其在定量上还有待进一步解决。参考文献：1 A. Cuadros-Inostroza, P. Giavalisco, J. Hummel, A. Eckardt, L. Willmitzer, H. Pena-Cortes, Anal. Chem. Discrimination of wine attributes by metabolome analysis J. Analytical Chemistry,2010, 82(9): 35733580.2 R

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38、traction techniques coupled to a new quantitative, sensitive, high throughput GCMS/MS method for methoxypyrazine analysis in wineJ. Talanta, 2016,148:336-345.24 HY Shen，WL Fan，XU Yan，LI Ji-Ming，YU Ying .Determination of Volatile Compounds in Red Wine by Headspace-Solid Phase Microextraction (SPME) a

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