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文档简介

1、基因克隆(分子克隆基因克隆(分子克隆molecular cloningmolecular cloning)-通过体外重组技术通过体外重组技术, ,将一段目的将一段目的dnadna经切割、连接经切割、连接插入适当载体插入适当载体, ,并导入受体细胞,进行永久保存和并导入受体细胞,进行永久保存和复制的过程。复制的过程。 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的 dnadna 克克 隆隆 过过 程程目目 录录1. 1. 化学合成法化学合成法要求:已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基要求:已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列酸序列 。2.2.基因组基因组dnadna文库文库(genomic

2、dna library)(genomic dna library)3. 3. cdnacdna文库文库( (cdnacdna library) library)4. 4. 分离克隆差别表达的基因分离克隆差别表达的基因 * * 化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的dnadna序列序列1. 1. 化学合成法化学合成法要求:已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基要求:已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列酸序列 。2.2.基因组基因组dnadna文库文库(genomic dna library)(genomic dna library

3、)3.3. cdna cdna文库文库( (cdnacdna library) library)4. 4. 分离克隆差别表达的基因分离克隆差别表达的基因 组织或细胞染色体组织或细胞染色体dnadnadnadna片断片断克隆载体克隆载体重组重组dnadna分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组dnadna文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组dnadna的集合的集合* * 从基因组从基因组dnadna文库文库获取目的基因获取目的基因目目 录录限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化

4、 除去中间片段除去中间片段coscos l lr r cos coscoscos l l左臂左臂r r cos cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体dnadna限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源dnadna与载体与载体dnadna混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 kb dna 20 kb dna 片段片段 coscos l lr r cos cos20 kb 20 kb 外源外源 dna dna 片段片段 基因文库基因文库目目 录录1. 1. 化学合成法化学合成法要求:已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基要求:已知

5、目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列酸序列 。2.2.基因组基因组dnadna文库文库(genomic dna library)(genomic dna library)3.3. cdna cdna文库文库( (cdnacdna library) library)4. 4. 分离克隆差别表达的基因分离克隆差别表达的基因 真核生物基因组真核生物基因组dnadna十分庞大,而且含有大量的重十分庞大,而且含有大量的重复序列。这是从染色体复序列。这是从染色体dnadna为出发材料直接克隆目的基因的为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。一个主要困难。 cdnacdna文库比基因组文库比基因组dn

6、adna文库小得多,能够比较容易从文库小得多,能够比较容易从中筛选中筛选到目的到目的基因。基因。l定定 义:义: (cdnacdna library library) 某种生物基因组转录的全部某种生物基因组转录的全部mrnamrna经反转录产生的经反转录产生的cdnacdna片片段分别与克隆载体重组,储存于某种受体菌中,该群体就称该段分别与克隆载体重组,储存于某种受体菌中,该群体就称该生物基因组的生物基因组的cdnacdna文库文库。l原原 理:理: 将带将带poly(a)poly(a)的的mrnamrna经酶促反应转变为双链经酶促反应转变为双链dnadna,再与,再与原核载体连接。原核载体连

7、接。mrna mrna cdna cdna 双链双链cdnacdna 重组重组dnadna分子分子 cdnacdna文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制* * 从从cdnacdna文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶a a a aa a a a t t t tt t t t aaaa aaaasisi核酸酶核酸酶 dnadna聚合酶聚合酶碱水解碱水解 t t t tt t t t目目 录录打开双链打开双链cdnacdna合成中产生的发夹环合成中产生的发夹环 mrna的制备 动物细胞mrna的制备 植物细胞mrna的制备关键问题:制备mrna(参考书p172

8、)、oligooligo( (dtdt) )引导的引导的dnadna合成法:合成法: 利用真核利用真核mrnamrna分子所具有的分子所具有的poly(a)poly(a)尾巴的特性,加入尾巴的特性,加入12-2012-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligooligo( (dtdt) )短片段,由反转录酶短片段,由反转录酶合成合成cdnacdna的第一链。的第一链。、随机引物引导的、随机引物引导的cdnacdna合成法合成法 见书图p174根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cdna的引物。在应用这种混合引物的情况下,cd

9、na的合成可以从mrna模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3-末端的oligo(dt)引物一处开始。1 1、自身引导合成法、自身引导合成法: 单链单链cdnacdna的的3 3端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶杆菌聚合酶i i klenow klenow或反转录酶的作用下,合成或反转录酶的作用下,合成cdnacdna的第二链。的第二链。1 1、自身引导合成法、自身引导合成法: 单链单链cdnacdna的的3 3端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶杆菌聚合酶i i klenow klenow或反

10、转录酶的作用下,合成或反转录酶的作用下,合成cdnacdna的第二链。的第二链。 缺缺 点:点: 在以在以s1s1核酸酶切割核酸酶切割cdnacdna的发夹状结构时,会导致对应于的发夹状结构时,会导致对应于mrnamrna 5 5端的地方的序列出现缺失和重排。端的地方的序列出现缺失和重排。 s1s1核酸酶的纯度核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链不够时,会偶尔破坏合成的双链cdnacdna分子。分子。原 理: 以rna酶h在第一链合成产物cdna:mrna杂交体的mrna链上造成切口和缺口,产生一系列rna引物,在大肠杆菌dna聚合酶i 的作用下合成cdna的第二链。 将合成的双链重组到质

11、粒载体或噬菌体载体上,将合成的双链重组到质粒载体或噬菌体载体上,转化大肠杆菌寄主细胞增殖。转化大肠杆菌寄主细胞增殖。由于种种原因(例如由于种种原因(例如rnarna制备过程中,由于制备过程中,由于rnarna不稳不稳定,获得定,获得55端或端或33端序列缺失的非全长端序列缺失的非全长mrnamrna。以。以此为模版合成非全长此为模版合成非全长cdnacdna。)。)cdnacdna常用常用cdnacdna文库的文库的构建技术获得的构建技术获得的cdnacdna并不是全长并不是全长cdnacdna,通常,通常55端或端或33端序列缺失。端序列缺失。 常用常用racerace技术技术克隆缺失的克隆

12、缺失的55端或端或33端缺失端缺失序列。序列。racerace技术(技术(rapid amplification ofrapid amplification of cdna cdna ends ends)是是一项在一项在已知已知cdnacdna序列的基础序列的基础上克隆上克隆55端或端或33端缺失端缺失序列的技术。序列的技术。获得高质量总获得高质量总rnarna去磷酸化去磷酸化去掉去掉mrna5mrna5帽子结构加帽子结构加特异性特异性rnarna寡聚接头寡聚接头合成第一条合成第一条cdnacdna链链5race5race3race3race将纯化后的将纯化后的pcrpcr产物产物克隆到载体克

13、隆到载体dnadna中,中,进行序列分析进行序列分析racerace主要操作方法主要操作方法 race race技术的作用技术的作用1.1.获取全长获取全长cdnacdna序列。序列。2.2.有助于研究有助于研究55端和端和33端非编码序列。研究转端非编码序列。研究转录起始位点,启动子等。录起始位点,启动子等。课本p176.rt-pcr.rt-pcrrt-pcrrt-pcr是以是以mrnamrna为模板,经逆转录酶作用合成为模板,经逆转录酶作用合成cdnacdna,再经再经pcrpcr扩增,扩增,大大提高大大提高mrnamrna的检出灵的检出灵敏度。敏度。主要主要应用于基因表达与调控的研究。应

14、用于基因表达与调控的研究。可用于克隆已知部分序列的基因(片段)的克隆。可用于克隆已知部分序列的基因(片段)的克隆。综合性实验。综合性实验。rt-pcrrt-pcrcdna1. 1. 化学合成法化学合成法要求:已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基要求:已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列酸序列 。2.2.基因组基因组dnadna文库文库(genomic dna library)(genomic dna library)3.3. cdna cdna文库文库( (cdnacdna library) library)4. 4. 分离克隆差别表达的基因分离克隆差别表达的基因 根据表达特性的差异

15、可将高等真核生物的基因分为两根据表达特性的差异可将高等真核生物的基因分为两大类:一类叫做大类:一类叫做看家基因(看家基因(house-keeping genehouse-keeping gene),以其,以其组成型表达模式维持细胞的基本代谢活动;另一类叫做组成型表达模式维持细胞的基本代谢活动;另一类叫做发发育调控基因(育调控基因(developmental regulated genedevelopmental regulated gene),以其时,以其时空特异性表达模式完成个体的正常生长、发育与分化,我空特异性表达模式完成个体的正常生长、发育与分化,我们将不同基因在生物个体发育的不同阶段,

16、或是在不同的们将不同基因在生物个体发育的不同阶段,或是在不同的组织或细胞中发生的按时间、空间进行有序表达的方式称组织或细胞中发生的按时间、空间进行有序表达的方式称为为基因的差别表达(基因的差别表达(differential expressiondifferential expression)。 1992年,美国波士顿年,美国波士顿dena-farber癌症研究所的两位科学癌症研究所的两位科学家家p. liang和和a. d. pardee发明了一种叫做发明了一种叫做mrna差别显示差别显示pcr(mrna differential display)技术,简称)技术,简称ddrt-pcr,可以从

17、一对不同类型的细胞群体可以从一对不同类型的细胞群体有效地分离并鉴定差别表达有效地分离并鉴定差别表达的基因。的基因。cdnacdna差示分析法差示分析法- rda- rda法法(representational difference analysis) (representational difference analysis) 充分发挥了充分发挥了pcrpcr以指数形式扩增双链以指数形式扩增双链dnadna模板模板的特性,通的特性,通过降低过降低cdnacdna群体复杂性和更换群体复杂性和更换cdnacdna两端接头等方法,特两端接头等方法,特异扩增了目的基因片段。异扩增了目的基因片段。试验对

18、象试验对象(testertester)供试探针供试探针(driverdriver)4 4碱基切割酶处理碱基切割酶处理平均长度平均长度256bp256bp的代表群的代表群cdnacdnacdnacdna加加12/2412/24碱基接头碱基接头补平末端补平末端以以2424碱基的互补序列为碱基的互补序列为引物进行引物进行pcrpcrt t改换新接头改换新接头d d不加接头不加接头杂交:杂交:t:d=1:100t:d=1:100设计新接头引物设计新接头引物pcrpcr指数扩增产物差异产物指数扩增产物差异产物 分子克隆载体是一类可供外源分子克隆载体是一类可供外源dnadna插入并插入并携带重组携带重组d

19、nadna分子进入适当宿主细胞的分子进入适当宿主细胞的dnadna分子。分子。将重点讲述将重点讲述分子克隆载体的特点分子克隆载体的特点; ; 常见分子克隆载体常见分子克隆载体; ; 运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力为外源基因提供复制能力为外源基因的扩增提供必要的条件为外源基因的扩增提供必要的条件、载体特点、载体特点1.1. 至少有一个复制起点,因而至少可在一种生物体中至少有一个复制起点,因而至少可在一种生物体中自主复制。自主复制。2.2. 至少应有一个克隆位点,以供外源至少应有一个克隆位点,以供外源dnadna插入。插入。3.3. 至少应有一个至少

20、应有一个遗传标记遗传标记基因,以指示载体或重组基因,以指示载体或重组dnadna分子是否进入宿主细胞分子是否进入宿主细胞polylinkerbamhipuc182686 bpaprlaczorigaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagctt396452ecorisstikpnismaixbaisalipstisphihindiiil、质粒载体、质粒载体l、噬菌体载体、噬菌体载体l、cosmidcosmid克隆载体克隆载体l、噬菌粒载体、噬菌粒载体l、酵母人工染色体载体、酵母人工染色体载体l、细菌人工染色体载体、细菌人工染色体载

21、体质粒质粒( (plasmidplasmid ) chromosomeplasmid原理:原理:t-vectort-vector两条链的两条链的5 5端含有一个游离的端含有一个游离的t t,pcrpcr过程中,普通的过程中,普通的taqtaq酶可在产物的酶可在产物的3 3端多端多加一个加一个a a穿梭质粒载体穿梭质粒载体(shuttleshuttle plasmid plasmid vector vector) 是一类由人工构建的具有是一类由人工构建的具有两种两种不同不同复制起点复制起点和和选择标选择标记记,因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒,因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的

22、质粒载体。载体。大肠杆菌大肠杆菌- -酿酒酵母穿梭质粒载体酿酒酵母穿梭质粒载体(三)外源基因与载体的连接(三)外源基因与载体的连接1. 1. 粘性末端连接粘性末端连接方式:方式:(1)(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接bam bam hh切割反应切割反应 ggatccggatcc cctagg cctaggt4t4 dnadna连接酶连接酶1515c cgatccgatcc g gg gcctagcctag目的基因用目的基因用 bam bam hh切割切割gcctaggcctaggcctaggcctaggatccggatccgga

23、tccggatccg载体载体dnadna用用bam bam hh切割切割gcctaggcctaggcctaggcctaggatccggatccggatccggatccg重组体重组体gcctaggcctaggatccggatccggcctaggcctaggatccggatccg载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接目目 录录不同限制酶切位点的连接不同限制酶切位点的连接gaattccttaagagatcttctagaeco eco rr切割位点切割位点gcttaaatctagaattcggatctabgbg ll切割位点切割位点aattcgatctagaa

24、ttcggatctaaattcgatctagecoecor r+ + bgbg ll双酶切双酶切eco eco r+ r+ bgbg ll双酶切双酶切gcttaaatctagaattcggatctat4t4 dnadna连接酶连接酶1515c c重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。2. 2. 平端连接平端连接适用于:限制性内切酶切割产生的平端适用于:限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶t4 dnat4 dna连接酶连接酶1515c c重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自

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