TSS法制备大肠杆菌感受态细胞

1、TSS法制备感受态1. 取感受态种子接种于含有LB的2ml试管中，37度振荡培养2. 将上述培养液用 LB按1: 100稀释后，37度振荡约3h （ OD为0.5土 0.03 ）3. 把培养物放 在冰上冷却后，2500rpm 4度离心10min,收集菌体，弃上清4. 使用前准备好 1X TSS（10% W/V PEG 3350, 50mM MgCl 2, 85%LB）5. 将收集到的菌体重悬于 1X TSS （每100ml培养物溶解于10ml的1X TSS ）,混匀。注 意保持冰上操作6. 用1.5ml EP管冰上分装，100 L/管，先放在液氮中速冻一下，后放于 -70保存20ml 1x T

2、SS:19ml 0.2033g 1.9gLBMgCl 2 ' PEG3350将LB和PEG3350混合后过滤（0.22）除菌 加 DMSO 1ml用前冰浴，4度保存TSS方法制备感受态细菌（一步法制备感受态细菌）TSS方法制备感受态细菌（又称一步法）一、准备工作1、缓冲液1X TSS的配制：事先配制1M的氯化镁一一20.3g氯化镁（6分子水结晶）/定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。取干净的100ml量筒和100ml烧杯，用量筒量取100ml去离子水，加入至烧杯中，取 1 g蛋白月东，0.5g 酵母抽提物，0.5g氯化钠，10 g PEG（MW= 3350）, 5ml DMSO

3、, 5ml的1 M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧 化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22um滤器过滤除菌。储存在 4度，保质期约6个月。2、 已划平板（或者用枪头沾取并稀释后涂布）并在培养箱中过夜培养的菌种一一Dh5a ,用于接种并振荡 培养。.两个锥形瓶，分别装有 30 ml和50mlLB,灭菌后置于4C冰箱备用。3、若干已灭菌的琼脂平板，一个未加抗生素，用于第二步的接种。其余做转化用。二、感受态制备程序：1、前一天晚上调单菌落至 30 mlLB中过夜培养（12-16h ）,按1: 100比例将过夜培养的菌液（500ul ）加 入到新鲜的50 ml LB培养液中，于 37 C振荡培养至 OD6

4、0髭勺为0.4（培养时间2h4050min）。冰浴30分 钟后4度1000g离心10min,弃上清，收获细菌。加入原体积十分之一（这里为5 ml ）的1X TSS液（冰预冷）悬浮细胞，然后分装成 100 ul/份，全部冰上操作，一80度保存。三、转化时取一管（100 ul）感受态细菌，（冻寸细胞应置于冰上缓慢融化后立即使用）加入 3-5ul DNA(0.1100ng)，轻轻混匀后冰浴 30min。加入0.9ml含20mmol/L葡萄糖的LB培养液，37度150r/min 温和振荡培养60min，涂布，室温放置约 20分钟后放于37度恒温培养箱过夜培养(17-20h )。制备高效率感受态的方法B

5、IOX.CN 2005-4-15 23:40:00 来源：丁香园液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等，在LB平板上划线，37度过夜至长出单菌落.挑直径1-3毫米的单菌落*可多个，接种到250毫升/3升锥形瓶或80毫升/1升锥形 瓶的SO昕养基.培养基量不可再多，会影响效率.在18度150-250RPM培养19-50小时*没有冷 却摇床的可在室温，但不可高于37度.OD600约0.4-0.8 时停止培养，放在冰水中冷却10分钟4 度,300RPM离心15分钟，回收菌体去掉上清后，用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮，在冷10分钟 再次离心回收菌体用1/12.

6、5体积的TB悬浮，添加最终浓度为 7%勺DMSO,再冷却10分钟0.1-1毫升分装，直接在液氮中冻上.在液氮或-80度保存.TB溶液 TRANSFORMATION BUFFERPIPES 3.0G 10mMCaCl2.2H2O 2.2g 15mMKCl 18.6g 250mMadd water up to 950ml用5N KOH调PH至6.7-6.8* 低PH不溶在加终浓度未55mM勺MnCl2.4H2O 10.9g定溶到1升，过滤灭菌，4度保存.但有人提出，冻存后转化效率降低，且这种方法不适合大质粒.【zihudie 】(1) 将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上，37C培养活化。(2

7、) 挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC夜体培养基，18C, 200-250rpm培养。(3) 当OD600=0.5-0.8时，用预冷的 40mL离心管于4C, 8000rpm离心10min,收集菌体。(4) 用预冷的 TB Buffer 重悬菌体，4C, 8000rpm离心10min,收集菌体。(5) 重复第4步操作。(6) 用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体，缓慢加入 DMS施终浓度7%。(7) 冰浴10min后，分装保存于液氮中。本法效率极高，建议大家采纳【yog】1. 单菌落2ml LB 37度120RPM过夜 1% 转接37 度200RPM2小时(OD至V0.40.5)2. 2m

8、l, 冰浴 15min, 4 度,6000RPM 5min, 弃上清，悬浮于 1ml0.1MCaCl2 中，冰浴 20min3. 4 度，6000RPM 10min, 重悬浮于 200ul 0.1MCaCl2 中，冰浴 30min建议用TSS法，简单方便，比氯化钙法的转化效率高.别的菌可能不一定适用。以下为转贴，具体方法请最好查阅文献。E.coli感受态细胞制备方法： 单菌落平板至 2ml LB, 37 oC 250 r/m ovn, 1ml 转至 50 ml LB, 37oC 250 r/m 至 A600 =0.2-0.4离心后用10毫升TSS重悬后，分装-70oC保存。尽量冰上操作. 转化

9、：加质粒(<5 ul/100ul cell) 后冰上30分钟，42oC 90秒，冰上 2分钟，加 LB至1ml ,37oC 1小时后铺抗生素平板。TSS: 7.0ml pH6.1 LB 2.0ml 50% PEG6000 0.5ML dmso 0.2ML Mg2+ (0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4) 0.3ml ddH2O高效感受态细胞制备:-70划出保存前株，于 LB平板上37Y培养过夜；用玻璃环挑取2-4个直 径2 mm左右的菌落，接种至50 ini SOB培养基中， 18Y剧烈震荡培养(200250r到0D阪为0.6左右；三角瓶放置冰上10 min,预冷后,将菌液转 移到同样预冷的离心管中.4,2500 g离心10 nun 回收细胞；