第八章 植物基因工程 总结

1、第八章第八章 植物基因工程植物基因工程n转基因植物转基因植物 将将外源基因外源基因导入导入植物细胞植物细胞，经，经组织培养组织培养，获得能够获得能够表达外源基因表达外源基因的植物称为转基因的植物称为转基因植物。植物。 抗虫抗虫 抗病抗病 抗逆抗逆 生产药物生产药物第一节 植物的转基因技术n植物细胞培养技术植物细胞培养技术n植物转基因技术的基本路线植物转基因技术的基本路线n转基因的受体系统转基因的受体系统n外源基因导入植物的方法外源基因导入植物的方法一、植物转基因技术的基本路线一、植物转基因技术的基本路线n分离目的基因分离目的基因n将目的基因与载体连接，形成重组将目的基因与载体连接，形成重组DN

2、ADNAn利用细菌繁殖扩增重组利用细菌繁殖扩增重组DNADNAn将与表达载体相连的重组将与表达载体相连的重组DNADNA导入到目标植导入到目标植物的细胞中物的细胞中n筛选转化细胞，并诱导产生转基因植株筛选转化细胞，并诱导产生转基因植株n转基因植株大规模种植转基因植株大规模种植三、外源基因导入植物的方法（一）（一）DNADNA直接转移法直接转移法n化学刺激法化学刺激法 PEGPEG、PNAPNA（肽核酸）、磷酸钙、氯化钙（肽核酸）、磷酸钙、氯化钙n电击法电击法n基因枪法基因枪法n花粉通道法花粉通道法 将外源将外源DNADNA片段在自花授粉后的特定时期注入片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，

3、外源柱头或花柱，外源DNADNA沿花粉管通道或传递沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化不具备细胞壁组织通过珠心进入胚囊，转化不具备细胞壁的受精卵，合子或早期胚体细胞。的受精卵，合子或早期胚体细胞。（二）载体介导法（二）载体介导法nTi 质粒介导的整合转化程序质粒介导的整合转化程序n植物病毒介导的转染程序（略）植物病毒介导的转染程序（略）1 Ti 质粒介导的整合转化程序nTi 质粒的结构与功能 双子叶植物尤其豆科植物的根部常常会由于植物根部双子叶植物尤其豆科植物的根部常常会由于植物根部被土壤杆菌农杆根瘤菌（被土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）形成根瘤，形成根瘤，其致瘤特性是

4、由该菌细胞内的野生型质粒其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒 Ti质粒质粒（Tumor-inducing plasmid）介导的，介导的，又称肿瘤诱又称肿瘤诱导质粒导质粒。 （1 1） Ti Ti 质粒的图谱区质粒的图谱区整个质粒整个质粒160 -240 kb160 -240 kb nT-DNAT-DNA区、区、nVirVir区、区、nConCon区、区、nOriOri区区转移DNA T-DNA（transfer-DNA）左边界左边界右边界右边界生长素生长素 基因基因细胞分裂细胞分裂 素基因素基因冠瘿碱冠瘿碱 合成合成tmstmstmttmttmrtmrnT-DNA 12 -24 kbT-DN

5、A 12 -24 kbntmstms的编码：合成吲哚乙酸的编码：合成吲哚乙酸ntmrtmr的编码：合成植物分裂素的编码：合成植物分裂素ntmttmt的编码：合成氨基酸衍生物冠瘿碱的编码：合成氨基酸衍生物冠瘿碱n在在T-DNA 的两端还含有左右的两端还含有左右2 个边界，长为个边界，长为25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程具的末端重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。有重要意义。 毒性基因（vir）决定土壤农杆菌对植物的感染和决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转的转移，移， 进入和整合。使根癌农杆菌表现出毒性进入和整合。使根癌农杆菌表现出毒性。Con 区区(regions encod

6、ing conjugations，接合转移编码区，接合转移编码区)：该区：该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移质粒在农杆菌之间的转移。Ori区区(origin of replication，复制起，复制起始区始区)：Ori区上的基因调控区上的基因调控Ti 质粒的自我质粒的自我复制。复制。 第一步第一步: :植物受伤植物受伤 乙乙酰丁香酮、酰丁香酮、 羟基乙酰丁香酮诱羟基乙酰丁香酮诱导导TiTi质粒的毒性基因表达。质粒的毒性基因表达。第二步第二步 感染植物感染植物 脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位脓杆菌吸附于植物的表面伤口

7、部位第三步第三步 毒性基因（毒性基因（virvir）表达）表达第四步第四步 T-DNA T-DNA转移转移 单链单链T-DNAT-DNA被切下来，整合到植物基因被切下来，整合到植物基因组中。组中。第五步第五步 诱导冠瘿瘤诱导冠瘿瘤T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。(2). 农杆菌的感染和生存裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（玉米）植物（玉米）能够自发地整合到植物的染色体上。能够自发地整合到植物的染色体上。 能转化多种植物。能转化多种植物。 强强启动子启动子

8、 (3).Ti质粒转化的对象(4). Ti质粒作为载体的可能性质粒作为载体的可能性T-DNA的的opine合成酶基因上有一个强合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。启动子，能启动外源基因的表达。n野生型野生型Ti Ti 分子大（分子大（200kb200kb）操作起来十分麻烦；）操作起来十分麻烦；n各种限制型酶切位点各种限制型酶切位点多多，切割，切割产生产生很大片段。很大片段。且且单单一的酶切位点一的酶切位点很少很少；ntmstms和和tmr tmr 基因产物干扰植物内源激素的平衡，产基因产物干扰植物内源激素的平衡，产生冠瘿瘤，阻碍转基因植物细胞的分化和再生；生冠瘿瘤，阻碍转基因植物

9、细胞的分化和再生；n无无大肠杆菌的复制起点和作为转化载体的选择标记大肠杆菌的复制起点和作为转化载体的选择标记基因。基因。 (5) 天然天然Ti质粒作载体的缺点质粒作载体的缺点（6）Ti 质粒的改造n除去除去T-DNA上的上的tmt，tms和和tmr生物合成生物合成基因基因； n除去除去 Ti 质粒的其它非必需序列，质粒的其它非必需序列，n安装大肠杆菌复制子，安装大肠杆菌复制子，n安装植物细胞的筛选标记，如安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，基因，使用植物基因的启动子和使用植物基因的启动子和polyA化信号序列；化信号序列；n插入人工多克隆位点，以利于外源基因的插入人工多克隆位点，以利于

10、外源基因的克隆。克隆。改造后的Ti质粒载体模式leftrightM C SAMProriVirselect(7)(7) Ti Ti载体的类型载体的类型n共整合载体（cointegrate vectors） 由比利时科学家由比利时科学家P.Zambrisky等等1983年改造年改造的的pGV3850 受体载体，需要同源重组才能插入外源基因。受体载体，需要同源重组才能插入外源基因。n双元载体（binary vectors） 既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。是个穿梭载体。pGV3850n特点：外源基因不能直接插入，需要借助特点：外源基因不

11、能直接插入，需要借助于于pBR322质粒作为中间载体质粒作为中间载体n选择标记选择标记脓杆菌选择标记脓杆菌选择标记 宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载体体pBR322上的卡那霉素抗性（上的卡那霉素抗性（Kanr）基）基因。卡那霉素抗性（因。卡那霉素抗性（ Kanr ）基因（卡那）基因（卡那霉素对植物有剧毒！）霉素对植物有剧毒！）最终受体植物的选择标记最终受体植物的选择标记 位于位于T-DNA右半部分的胭脂碱合成酶基因右半部分的胭脂碱合成酶基因（nos）。）。外外源基因插入源基因插入pGV3850的过程的过程外源基因外源基因Kanr pBR322土壤农杆菌土

12、壤农杆菌 含含pGV3850植物组织植物组织卡那霉素筛选卡那霉素筛选胭脂碱筛选胭脂碱筛选抗卡那霉素抗卡那霉素 的土壤农杆菌的土壤农杆菌外源基因外源基因 表达鉴定表达鉴定转化转化插入插入感染感染pBR322与与pGV3850重组重组整合到整合到 染色体上染色体上pBR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同不能在土壤农杆菌中复制，只能同pGV3850重组。只有这样，土壤农杆菌才能得重组。只有这样，土壤农杆菌才能得到抗卡那霉素性状。到抗卡那霉素性状。转化后可诱导愈伤组织分化成转基因植物共共整整合合转转化化程程序序双元载体（双元载体（binary vectors）能在大肠杆菌和农杆菌中复制，是穿梭载体。

13、能在大肠杆菌和农杆菌中复制，是穿梭载体。n双元载体的结构双元载体的结构 Ti质粒被剔除了质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、冠瘿碱代谢基因、vir基因。基因。 大幅度减小质粒的体积。（大幅度减小质粒的体积。（10kb）Ti的精髓：的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合）基因（转移）和左右界（整合）双元载体的转化双元载体的转化n基因插入基因插入 转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大肠杆菌里操作。肠杆菌里操作。n帮助质粒（帮助质粒（ helper plasmid） 受体农杆菌内要求带有整套受体农杆菌内要求带有整套vir基因（但缺基因（但缺失失T-DNA及左

14、右边界）的及左右边界）的“帮助质粒帮助质粒”提提供供vir产物。产物。左左右右外源基因外源基因双元载体双元载体Vir帮助质粒帮助质粒农杆菌农杆菌Vir农杆菌农杆菌左左右右外源基因外源基因感染植物感染植物转化转化左左右右外源基因外源基因进入植物细胞核，进入植物细胞核，整合，表达整合，表达E.colin双元系统是穿梭质粒和双元系统是穿梭质粒和TiTi质粒两个质粒质粒两个质粒 ，在接合，在接合后可以自主性地共存于同一农杆菌细胞中。后可以自主性地共存于同一农杆菌细胞中。n穿梭质粒编码植物选择标记穿梭质粒编码植物选择标记、表达信号表达信号、多克隆多克隆位点位点、两个两个T-DNAT-DNAn双元系统中的

15、双元系统中的 Ti Ti 具有具有VirVir基因和农杆菌复制起基因和农杆菌复制起始子始子(OriA)(OriA)，但没有，但没有T-DNAT-DNA边界序列。边界序列。n接合后，两个质粒可以自主共存于同一农杆菌细接合后，两个质粒可以自主共存于同一农杆菌细胞中。胞中。 穿梭质粒穿梭质粒可在农杆菌内自主复制可在农杆菌内自主复制n插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有TiTi质质粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。双元系统的特点双元系统的特点第三节第三节 植物转基因技术在植物品种改良植物转基因技术在植物品种改良中

16、的应用中的应用n控制果实成熟的转基因植物控制果实成熟的转基因植物n抗病虫害的转基因植物抗病虫害的转基因植物n抗除草剂的转基因植物抗除草剂的转基因植物n改变花卉形状和颜色的转基因植物改变花卉形状和颜色的转基因植物n抗环境压力的转基因植物抗环境压力的转基因植物n产高品质产物的转基因植物产高品质产物的转基因植物转基因育种的程序转基因育种的程序基因分离基因分离体外重组转化转化体安全性评价结合常规育种转基因品种遗传稳定性评价市场开发载体的构建农杆菌介导基因枪轰击筛选 转基因植物引发的安全事件转基因植物引发的安全事件n英国英国Pusztai事件事件n康奈尔大学斑蝶事件康奈尔大学斑蝶事件n 加拿大加拿大“超级杂草超级杂草”事件事件n 墨西哥玉米事件墨西哥玉米事件n 中国中国Bt抗虫棉事件抗虫棉事件七、转基因生物潜在危害 潜在危害潜在危害n转基因食品可能具有毒性转基因食品可能具有毒性 ;n转基因食品可能产生过敏反应转基因食品可能产生过敏反应; n