植物组织培养课件-1

1、植物组织培养植物组织培养龚玉莲龚玉莲n36学时n理论课24学时，实验课12学时。n植物组织培养，潘瑞炽主编。n植物细胞工程，潘瑞炽主编，广东高等教育出版社，2006绪论绪论n概念n细胞的全能性n植物组织培养的发展史n应用 一一 概念概念1 植物组织培养（plant tissue culture）n 广义：是指在无菌条件下，利用人工培养基对植物及其器官、组织、细胞和原生质体等的离体培养，简称组培。 n 指植物的任何器官、组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化形成完整植株的过程。n狭义的概念：指愈伤组织培养，而愈伤组织培养也是一种最常

2、见的培养形式。n 培养基(medium)：用来培养植物（也可以是其他生物）的基质。n 外植体(explant)：在组培中用于离体培养的对象叫外植体。2 分类分类（1）根据培养对象外植体的不同，把植物组织培养分成5个水平：即整体的、器官的、组织的、胚胎的、细胞的和原生质体的培养。n植株培养(plant culture) ：以具备完整植株形态的材料为外植体的无菌培养，比如幼苗、植株。n器官培养organ culture)：以植物的器官作为外植体的培养，比如根、茎、叶、花、果实、，更具体一些可以是根尖、根切段、茎尖、茎节、茎切段、叶原基、叶片、叶柄、叶鞘、子叶、花瓣、花药、胚、胚珠、子房等等。 n

3、组织培养(tissue culture)：以植物各个部位的组织作为培养对象，这是狭义的组织培养的含义，比如：分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层、胚乳组织、薄壁组织、髓部，或诱导的愈伤组织等等。n细胞培养(cell culture)：以单个细胞为培养对象的外植体，这种细胞可以是体细胞、花粉细胞、卵细胞等。n原生质体培养protoplast culture)：以原生质体为外植体的培养。（2）根据培养过程 将从植物体上分离下来的部分进行第一次培养，称为初代培养（primary culture）； 以后将培养物转移到新的培养基上继续培养，则统称为继代培养（subculture）。 （3）根据

4、培养基的物理状态 加入琼脂使培养基呈固体状态的培养，称固体培养（solid culture）； 不加入琼脂而培养基呈流体状态的培养，称为液体培养(liquid culture)。3 组织培养的优越性和特点组织培养的优越性和特点 优越性：可以在不受植物体其他部分干扰的情况下研究被培养部分的生长和分化的规律。 特点：取材少，培养材料经济；ren为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制。 4 植物生物技术植物生物技术 又称植物生物工程，是按照人类的意愿有目的地改良植物的一种新技术，是当前世界新技术革命的一个重要组成部分。 组织培养是植物生物技术的主要分支之一，

5、在理论上是研究细胞学、遗传学、育种学、生物化学和药物学等学科的重要手段；在生产上在农学、园艺、林业和次生代谢产物工程等生产领域得到广泛应用。因此，组织培养在理论研究和生产实践中都十分重要。二二 细胞的全能性细胞的全能性n植物组织培养的理论依据n为什么一个外植体（小到一个细胞甚至是原生质体）能在离体条件下发育成一个完整的植株，这是因为细胞具有全能性（totipotency）。 细胞的全能性：细胞的全能性： 任何具有完整细胞核的植物细胞，都具有母体植株的所有遗传信息，在适宜的条件下，能按母株的表型完整的加以表达，在形态建成上具有再生成完整植株的潜势，在代谢上具有合成原植株所含有的代谢产物的能力。

6、也就是说，只要外界条件适宜，任何一个具有完整细胞核的细胞，在理论上，都可以发育成一个完整的植株。其实。动物细胞也具有全能性，只是目前的研究工作中成功的远比植物少（克隆绵羊即是一例）。 细胞的全能性是植物组织培养的理论基础，表明了植物组织培养在理论上的可能性。 要想让这一可能性变为现实性，必须给外植体以适宜的外部条件。（可能性只是内因，必须通过外因才能起作用） 要使细胞全能性表达出来，形成完整植株，除了生长以外，还要经过分化、脱分化和再分化等过程。三三 植物组织培养的发展史植物组织培养的发展史 从其发展历史可看出细胞全能性是怎样由可能性逐步变为现实性的。 植物组织培养的历史可以追索到上世纪末和本

7、世纪初，它的快速发展只是近几十年的事。组织培养的发展大致可分为以下三个阶段： 探索阶段、奠基阶段、迅速发展阶段。 1 探索阶段（探索阶段（20世纪初世纪初30年代中）年代中） 在Scheiden和Schwan所发展起来的细胞学说的基础上，德国著名植物生理学家Haberlant进一步提出了“高等植物的器官和组织可以不断地分割，直到分成单个细胞”的观点。 即先提出任何生物都是由细胞构成，在提出这些细胞可以单个的分离出来的观点。 并首次进行了离体培养实验，用的材料是小野芝麻和凤眼蓝的栅栏组织，和虎眼万年青属植物的表皮细胞等，观察到了细胞的生长，但未见细胞分裂。 Haberlant于1902年提出细胞

8、全能性的概念，认为离体培养的植物细胞具有通过胚胎发生过程而发育成完整植株的潜在能力。 为了证实这一点，他用叶肉细胞、髓细胞等进行离体培养。由于取材及技术上的原因，并未获得成功。 由于在这个时期内激素未被发现，因此几乎没有什么进展，只是停留在探索阶段。 但是Haberlant的观点却鼓舞后人继续探索和追求。2 奠基奠基阶段（阶段（30年代中年代中50年代末）年代末） 在这个阶段，实现了对离体细胞生长和分化的控制，这是通过对培养条件和培养基成分的广泛研究获得的，这样，细胞全能性就从可能性变成了现实性。 由于发现了生长素和维生素，才有以下成就。 （1）30年代： White,1934，美国。由番茄根

9、建立了不断生长的根尖的无性繁殖系。 起初使用的培养基中加入了无机盐、酵母浸出液、蔗糖，首次获得了真正成功的组织培养； 后来，他用3种B族维生素：吡哆醇（Vb6）、硫胺素（Vb1）和烟酸（Vb3），取代了酵母浸出液，并获得了同样成功的效果。 这一实验的意义在于：首次证实了组织培养的可行性；对培养基成分（尤其是维生素）进行了探索。这种加了B族维生素的培养基被称为White培养基。 他所建立的根培养物一直保存到他逝世（1968年）之前不久（30多年）。White在1939年报道了由烟草种间杂种幼茎切段的形成层组织，进行了类似组织培养，获得成功并能继代培养，他提出植物细胞全能性学说。Gautheret

10、, 法国，1934。 发现在Knop溶液中加B族维生素、IAA能促进山毛柳形成层生长。1939年，连续培养胡萝卜形成层获得成功。 同年，烟草种间杂种的瘤组织（White）和胡萝卜（Nobecourt）也建立了类似的连续生长的组织培养物。（实际上是一团未分化并再继代培养的愈伤组织） 因此，Gautheret、White和Nobecourt被称为植物组织培养的奠基人。 我们现在所用的若干种培养基和培养方法，原则上都是在1939年所建立的方法和培养基演变的结果。 我国的3位植物生理学家：李继侗、罗宗洛、罗士韦。 他们早在30年代就开始了组培的研究，是我国组培工作的奠基人。 罗士韦在30年代即开创离体

11、根培养，随着有进行幼胚和茎尖培养，解放后特别在70年代以后，身体力行，指导植物组织培养技术的推广工作，取得了很大的成效。 归结30年代的成就为： 首次获得了离体连续培养的成功； 发现维生素、生长素能促进生长（但未涉及分化，这是因为细胞分裂素尚未发现）。（2）40年代： Overbeek，1941。在培养基中加入椰子汁，使曼佗罗的心形期幼胚能够离体培养至成熟，以后椰子汁在组培中得到广泛的应用。 Skoog，崔澄。对嘌呤类物质（腺嘌呤、腺苷）的作用进行了研究，发现它们不仅能促进愈伤组织的生长，还能解除培养基中生长素对芽形成的抑制作用、诱导芽的形成，从而确定腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要

12、条件之一。他们进行烟草髓培养诱导根、芽器官，获得成功。这些工作的意义在于： 导致了细胞分裂素的发现为组培中器官分化奠定了基础。 Miller,1955。 从鲱鱼精子DNA中分离出一种首次为人所知的细胞分裂素，命名为激动素（Kinetin，KT）。 现在，把具有激动素类似活性的合成的或天然的化合物总称为细胞分裂素（cytokinin，CTK）。 Skoog，Miller，1957。提出了有关激素控制器官形成的概念。 提出生长素/细胞分裂素的比例控制了根、茎的分化：比值高，促进生根；比值低，促进长芽；相当时，组织则倾向于以一种无结构的方式生长。（后来的研究表明，必须把内源激素水平考虑进去） 这样，

13、由于细胞分裂素的发现，使组培进入了器官分化的阶段。 这个时期还发现了分化过程中的体细胞胚发生途径，以及一些培养技术上的改进（如看护培养）。 1958年，美国Steward等和德国Reinert等分别由培养的胡萝卜根细胞诱导形成了胚状体，形成新植株，这一过程与胡萝卜的受精卵形成合子胚的发育极为相似。这就用实验证明了植物细胞的全能性。 在奠基阶段，通过对培养条件（尤其是激素）的研究，实现了细胞的全能性，为植物组织培养的发展和实际应用打下了基础。 3 3 迅速发展阶段（迅速发展阶段（60年代以后）年代以后） 60年代以后，随着组培理论、技术的系统化，植物组织培养有了飞速的发展。1960年 首次分离出

14、原生质体197 1971年 由原生质体再生出植株 由花药培养成单倍体植株、兰花的微繁技术。等等。 目前，植物组织培养已经成为一个专业技术、 常规手段，应用广泛。 4 我国的植物组织培养技术我国的植物组织培养技术 发展很快，在很多方面都具有世界领先水平；我国也有很好的组培基础，普及面广。 近几十年，我国植物组织培养研究工作取得了很大的成就。 例如，从花药诱导出许多优良的水稻、小麦、烟草等品种，在花药培养和单倍体育种上，一直处于国际先进水平。 又如，应用快速繁殖技术，繁殖出大量优良的甘蔗、香蕉、菠萝、杨树、桉树和花卉种苗，对农业和林业生产做出了较大的贡献。 从细胞在组织培养中的变化也可以看出组培的

15、发展。 细胞，尤其是已经分化的细胞，要实现其全能性，必须经过两个阶段：先脱分化，然后再分化。再分化又包括各个器官（尤其是根、茎）的分化。这一切的前提是要能把细胞（组织、器官）从母体植株中分离出来。 分离 脱分化 再分化植株 细胞 愈伤组织 植株 细胞学说 分离细胞 离体器官分化的方式有许多种，典型的有三种：一是由分生组织直接分生芽；二是由分生组织形成愈伤组织，经过分化实现细胞的全能性；三是游离细胞或原生质体形成胚状体（embryoid），由胚状体直接重建完整植株，或制成人工种子后再重建植株。 实际上，实现细胞全能性的根本就是找到适合的培养条件。 与目前的热点“克隆”动物相比，植物克隆早在几十年

16、前就已经实现，并且在很多植物上都已经成功，这可能有植物本身的再生能力强有关（植物能不断长根、茎、叶，动物不行）。另一方面，在同样具有全能性的前提下，对于培养条件的研究，动物方面远不及植物。四四 应用应用理论研究实践 改良品种、扩大繁殖 获得一些植物体内天然的物质 植物组织培养已经应用于理论、实践生产的很多方面。 1 无性系快速繁殖2 花药培养和划分单倍体育种3 药用植物的工厂化生产4 种质的保存和基因库的建立5 突变体的筛选培育。大花蕙兰（大花蕙兰（Cymbidium）组织培养技术组织培养技术香蕉的组织培养香蕉的组织培养 紫草的有效成分-紫草宁，具有消炎和生物色素等功效，在日本被用来生产生物口

17、红。 自然条件下，紫草23年才能收获，且紫草宁含量低仅为1%2%，市场供不应求，不能满足需要，价格高达4500美元/公斤； 而利用植物组织培养的手段来获得紫草宁，只需3周就能收获，且含量高达14%，大大降低了成本、提高了产量。 第一章第一章实验室的基本设备和培养基实验室的基本设备和培养基 一 实验室设计二 培养基一一 实验室设计实验室设计 一个组织培养实验室的面积大小和装备程度取决于两个因素： 所要进行的实验的性质 经费的多少一个完整的实验室应包括以下5部分： 化学实验室 洗涤消毒室 无菌操作室 培养室 对培养物观察和鉴定的细胞学实验室。 这5个实验室最好能封闭，安装空调，以减少外界污染。 这

18、里讨论的是标准的组培实验室应具备的条件，实际应用起来视具体情况对待。 此外，工业化生产还需要相应的发酵设备和用于栽培试管苗的专用花房或遮荫棚。1化学实验室化学实验室 1) 作用：存放各类化学试剂，配制培养基，开展理化分析工作等。 2) 所需设备： 药品柜-放置常规药品 工作台-高度要适于站着工作。以前常用桌子代替（有的在桌子铺一层橡胶、地板胶），也有用水泥台，现在有专门的实验室工作台出售。冰箱低温冰箱 用来长期存放贮备液、椰子汁等、植 物材料等等普通冰箱 作用一样，但对于一些要求低温的东 西则只能短期贮存超低温冰箱超低温冰箱 蒸馏水发生装置 一套，包括蒸馏水发生器，大桶，也可用无离子水（有些用

19、双蒸水，甚至三蒸水） 天平 最好有1个精确度高（0.001克）的天平，过去常用分析天平，现在多用电子天平，还、需要1个精确度较低的天平（1克）。 酸度计 调pH值。可用精密pH试纸代替。电炉 用来加热，促进药品溶解，有时也用恒温水浴锅、微波炉。 此外，还需有各种理化分析的设备（根据实验目的来安排）。 以上都是必须的常规设备。 如果条件允许，还可以用电热磁搅拌器（溶解化学药品），真空泵等等。 当然，必须的水电及玻璃仪器不可少。 2 洗涤消毒室洗涤消毒室 1) 作用：清洗器皿、干燥器皿，消毒培养基或 器材。 2) 设备： 高压灭菌锅 组培中最基本的设备之一。对培养基和用具进行蒸气消毒，有手提式、立

20、式、卧式和电脑控制型，有大有小，也可用家用压力锅进行消毒的（例如家庭自制果酱）。注意，操作时，工作人员不应离开。 烘箱（干燥箱） 干燥器皿，也可用来消毒。注意，夜间应切断电源。 防尘橱 用以贮存干净的器皿。 清洗设备 桶、盆、各式毛刷，现在有用超声波来洗。3 无菌操作室无菌操作室1 1）作用：各种无菌操作（包括消毒、接种、的制备、继代、转移等等）。 对无菌操作室的要求：无尘、无对流空气的非常洁净的实验室。能较长时间保持无菌状态；内墙干燥密闭性好（尤其是在南方，高温多湿，对无菌操作室的要求更高，否则污染率很高）。 所以，在设计时，最好设内外两间，外间为缓冲间，内间是无菌操作室。 缓冲间可使工作人

21、员进入无菌操作室前有一个过渡，以减少室外杂菌进入无菌操作室。缓冲室可放置工作服、工作帽、拖鞋等，也可用紫外灯随时进行灭菌。无菌操作室的墙壁和地面要光滑，便于清洗和消毒。除了入口和通风口外，均应密封和安装滑门，以减少室内外空气对流，污染室内环境。2）设备 超净工作台 广泛用于用于无菌操作，有水平式单人或双人超净工作台，和垂直式单人或双人超净工作台。一般由鼓风机、滤板、操作台、紫外灯和照明灯责成。 超净工作台超净工作台超净工作台的工作原理超净工作台的工作原理 每架超净工作台内部都装有1个小电动机，它带动风扇鼓动空气先穿过1个粗过滤网，在那里把大的尘埃滤掉，进而在穿过1个称做高效过滤器的细菌过滤器，

22、把大于0.3m的颗粒都滤掉。然后这种不带有真菌和细菌的“超净空气”吹过台面上的整个工作区域，在操作人员和操作台之间形成风障，使杂菌不能进入，形成一个无菌的工作面。有高效过滤器吹出来的空气的速度大约是273m/min，这个气流速度足以阻止工作区被坐在工作台前的操作人员所污染，所有的污染物都会被这种超净气流吹跑。只要超净工作台不停的运转，在台面上即可保持一个无菌的环境。 为了延长过滤器的使用寿命，超净工作台不应安装在尘埃太多的地方（所以无菌操作室最好密闭）。否则过滤器将会很快堵塞，失去滤过作用，这常常是造成接种或继代的材料大批污染的一个重要原因。因此，定期检查超净工作台面上的风速是很有必要的。初次

23、使用新的超净工作台时，应在开动以后等待20分钟在开始操作，以后每次等待10分钟即可。每次使用时，把要用的东西先放进去，最好不要中途拿进去；台面上放置的东西不宜太多，以免挡住气流。使用酒精灯时要注意安全。 紫外灯 消毒空气，减少室内污染。（注意人 在室内时，不要开紫外灯）手持喷雾器 在超净工作台内喷洒酒精进行消毒物品架 存放各种用具（一般指灭过菌的用具）接种工具：镊子、尖刀、解剖刀、酒精灯、双 筒实体显微镜。 根据工作需要，还可以配备离心机、抽气泵、解剖镜等。 4 培养室培养室1）作用：提供离体培养物生长的场所，最好能 控制光、温、湿。 2) 设备： 培养架 放置培养物。可以是木制的，也可以是金属架，根据需要来购买或订做。一般采用多层的培养架来节约空间、降低成本。高度可达天花板。每层间隔35-45厘米，长130-150厘米。 光源 一般装在培养架上。根据光质不同选择不同的灯管，最好装24只，便于调整光强。多用40W的白色日光灯。暗培养用专门的暗箱，或用黑布遮光。现有自动定时器，自动控制光照时间。总之，要能达到光质、光强、光照时间的可调节。 控温设备 室内温度大多要求在25左右。多用空调机、热风机来调节温