第2章__核酸的分离纯化

1、第二章 核酸的分离纯化uDNADNA和和RNARNA是生物体中最重要的核酸分子，是是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象分子生物学和分子诊断的研究对象uDNADNA和和RNARNA的分离纯化是分子生物学研究及分的分离纯化是分子生物学研究及分子诊断最基础的工作子诊断最基础的工作核酸分离纯化的核酸分离纯化的原则原则: :u保持核酸一级结构的完整性保持核酸一级结构的完整性u尽可能提高核酸制品的纯度尽可能提高核酸制品的纯度核酸分子提取的技术路线I. I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.I

2、V.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中第一节第一节 核酸分离纯化的设计及原则核酸分离纯化的设计及原则第二节第二节 基因组基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化第三节第三节 质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化第四节第四节 RNARNA的分离纯化的分离纯化第五节第五节 核酸的保存与鉴定核酸的保存与鉴定第一节 核酸分离纯化的设计及原则一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择二、技术路线的设计二、技术路线的设计三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存（一） 材料与方法的选择 不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、不

3、同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的要求。产量及浓度有不同的要求。u需考虑制备核酸所需的时间与成本需考虑制备核酸所需的时间与成本u应选择安全的试剂与制备方案应选择安全的试剂与制备方案一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择 1.1.保持核酸碱基序列的完整性保持核酸碱基序列的完整性 2.2.尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度 3.3.保持核酸的完整性保持核酸的完整性 尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏尽量避免各种有害因素对核酸的破坏 （二）（二） 选择原则选择原则一、材料与方

4、法的选择一、材料与方法的选择二、技术路线的设计二、技术路线的设计（一）核酸的释放（一）核酸的释放（二）核酸的分离与纯化（二）核酸的分离与纯化（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤（一）核酸的释放 DNADNA和和RNARNA均位于细胞内（病毒除外），因均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的此核酸分离与纯化的第一步第一步即是裂解细胞、释即是裂解细胞、释放核酸。放核酸。 应该清除的杂质主要包括应该清除的杂质主要包括: : 1. 1.非核酸的大分子污染物非核酸的大分子污染物 蛋白质、多糖及脂类物质等蛋白质、多糖及脂类物质等 2.2.非需要的核酸分子非需要的核酸分子 分离某一

5、核酸分子时，其它核酸皆为杂质分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质 3.3.加入的有机溶剂和某些金属离子加入的有机溶剂和某些金属离子（二）核酸的分离与纯化（二）核酸的分离与纯化（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤u沉淀沉淀是是浓缩浓缩核酸最常用的方法核酸最常用的方法u常用的常用的盐类盐类: :醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁钠、氯化钾及氯化镁u常用的常用的有机溶剂有机溶剂: :乙醇、异丙醇和聚乙二醇乙醇、异丙醇和聚乙二醇u核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%70%75%75%的乙醇的乙醇洗涤洗涤去除去除三、核酸的鉴定与保

6、存三、核酸的鉴定与保存（一）核酸的鉴定（一）核酸的鉴定（二）核酸的保存（二）核酸的保存（一）核酸的鉴定（一）核酸的鉴定1.1.浓度鉴定浓度鉴定2.2.纯度鉴定纯度鉴定3.3.完整性鉴定完整性鉴定 紫外分光光度法：紫外分光光度法： 核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm260nm。 1.1.浓度鉴定浓度鉴定 各种碱基的紫外吸收光谱各种碱基的紫外吸收光谱 荧光光度法：荧光光度法： 核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在本身无荧光的核酸在 U

7、V UV 激发下发出红色荧光。激发下发出红色荧光。荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。EBEB与与DNADNA的结合的结合 紫外分光光度法：紫外分光光度法： 主要通过主要通过A A260260与与A A280280的比值来判定有无蛋白质的比值来判定有无蛋白质的污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度的污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳。不佳。 2. 2. 纯度鉴定纯度鉴定1.DNA1.DNA或或RNARNA的定量的定量ODOD260260=1.0=1.0相当于相当于 50 50g/mlg/ml双链双链DNADNA 40 40g/mlg/ml

8、单链单链DNADNA（或（或RNARNA） 20 20g/mlg/ml寡核苷酸寡核苷酸2.2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度 DNA DNA纯品纯品: : ODOD260260/OD/OD280 280 = 1.8= 1.8 RNA RNA纯品纯品: : ODOD260260/OD/OD280 280 = 2.0= 2.0荧光光度法：荧光光度法： EBEB等荧光染料示踪的核酸电泳可判定核等荧光染料示踪的核酸电泳可判定核酸制品的纯度。酸制品的纯度。琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：u以以EBEB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性制品的完整性u基因组基

9、因组DNADNA如果发生降解，电泳图呈拖尾状如果发生降解，电泳图呈拖尾状 3.3.完整性鉴定完整性鉴定DNADNA的降解的降解 完整的或降解很少的完整的或降解很少的总总RNARNA电泳图谱中，三条电泳图谱中，三条带荧光强度应呈特定的比值。带荧光强度应呈特定的比值。u沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高u沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低 u28S28S（或（或23S23S）RNARNA的荧光强度一般约为的荧光强度一般约为18S18S（或（或16S16S）RNARNA的的2 2倍，否则提示有倍，否则提示有RNARNA的降解

10、的降解u若在点样孔附近有着色条带，提示可能存在若在点样孔附近有着色条带，提示可能存在DNADNA的污染的污染（二）核酸的保存（二）核酸的保存1.DNA1.DNA的储存的储存2.RNA2.RNA的储存的储存 溶于溶于TETE缓冲液中的缓冲液中的DNADNA在在-70-70冰箱可保存数年。冰箱可保存数年。 TETE的的pHpH为为8.08.0时，时，DNADNA的脱氨反应减少，的脱氨反应减少，pHpH低低7.07.0时时DNADNA易变性。易变性。 1. DNA 1. DNA的保存的保存 2.RNA的保存 RNARNA溶于溶于H H2 2O O或或0.3mol/L0.3mol/L的的NaAcNaA

11、c溶液中，溶液中，-70 -70 保存保存 RNARNA溶液中加入溶液中加入RNasinRNasin或或VRCVRC，可延长保存时间，可延长保存时间 用于配置试剂及溶解用于配置试剂及溶解RNARNA的的H H2 2O O均应经均应经DEPCDEPC处理处理第二节 真核基因组DNA的分离纯化生物体组织细胞生物体组织细胞玻棒缠绕法玻棒缠绕法酚抽提法酚抽提法基因组基因组 DNA粗品粗品PFGE分离分离特定的特定的DNA片段片段AGE分离分离PAGE分离分离乙醇沉淀洗涤乙醇沉淀洗涤基因组基因组DNA纯品纯品精分离精分离粗分离粗分离前处理前处理离子交换层析纯化离子交换层析纯化有机溶剂抽提有机溶剂抽提细胞

12、裂解蛋白质变性沉细胞裂解蛋白质变性沉淀降解淀降解DNA释放释放甲酰胺解聚法甲酰胺解聚法 哺乳动物基因组哺乳动物基因组DNADNA分离纯化的一般技术路线分离纯化的一般技术路线基因组基因组DNA的提取的提取 - 酚抽提法酚抽提法样品的准备细胞的裂解蛋白质变性DNA的抽提DNA的沉淀血基因组血基因组DNA试剂盒试剂盒酵母基因组酵母基因组DNA试剂盒试剂盒细菌基因组细菌基因组DNA试剂盒试剂盒细胞基因组细胞基因组DNA试剂盒试剂盒一、酚抽提法一、酚抽提法二、甲酰胺解聚法二、甲酰胺解聚法三、玻棒缠绕法三、玻棒缠绕法四、其它方法四、其它方法五、五、DNADNA片段的纯化片段的纯化六、六、DNADNA片段的

13、回收片段的回收 一、酚抽提法u19761976年由年由StaffordStafford及其同事创立，现在使用的及其同事创立，现在使用的是改进的方法是改进的方法u以含以含EDTAEDTA、SDSSDS及及RNaseRNase的的裂解缓冲液裂解细胞裂解缓冲液裂解细胞u经经蛋白酶蛋白酶K K处理后，用处理后，用pH8.0pH8.0的的TrisTris饱和酚饱和酚抽提，抽提，获得获得DNADNA粗制品粗制品二、甲酰胺解聚法 19871987年年KupiecKupiec等报道了甲酰胺解聚法，等报道了甲酰胺解聚法，其其中细胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽提法，但中细胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽提法，但不进行酚

14、的抽提。不进行酚的抽提。 三、玻棒缠绕法玻棒玻棒缠绕法是在缠绕法是在Bowtell(1987)Bowtell(1987)方法的基础上经改进而来方法的基础上经改进而来四、其它方法 有些分子诊断技术并不需要高分子量的有些分子诊断技术并不需要高分子量的DNADNA样品，因此步骤简化、操作简便的样品，因此步骤简化、操作简便的DNADNA快速快速提取法广泛使用。提取法广泛使用。 1.1.异丙醇沉淀法异丙醇沉淀法 2.2.玻璃珠吸附法玻璃珠吸附法五、 DNA片段的纯化 常用的纯化方法：常用的纯化方法： 有机溶剂抽提法有机溶剂抽提法 柱层析法（柱层析法（column chromatographycolumn

15、 chromatography）六、 DNA片段的回收原则与要求原则与要求: : 1. 1.提高片段的回收率提高片段的回收率 2.2.清除回收的清除回收的DNADNA样品中的杂质样品中的杂质（二）（二） 从聚丙烯酰胺凝胶中回收从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNADNA片段片段（一）（一） 从琼脂糖凝胶中回收从琼脂糖凝胶中回收DNADNA片段片段1.1.二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基- -纤维素膜插片电泳法纤维素膜插片电泳法2.2.电泳洗脱法电泳洗脱法3.3.冷冻挤压法冷冻挤压法4.4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法 （一） 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段（二）从聚丙烯酰胺凝胶中回收D

16、NA片段 标准方法是压碎与浸泡法。费时但操作简标准方法是压碎与浸泡法。费时但操作简单，是小片段单，是小片段DNADNA回收的较好方法。回收的较好方法。第三节 质粒DNA的提取与纯化 u质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子其大小范围从lkb至200kb以上不等已经在形形色色的细菌类群中发现质粒这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。u质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术。 质粒特性质粒特性1. 分子相对小 2. 含有高效的自主复制成分 3. 不

17、相容性4. 转移性5. 选择的标记6. 限制性内切酶单一切。质粒质粒DNADNA的提取和纯化的提取和纯化 1 1细菌的培养细菌的培养 先分离单个菌落，接种先分离单个菌落，接种到含少量适当抗生素的到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒菌的生长，质粒DNADNA也也在自主复制。在自主复制。质粒质粒DNA的小量制备的小量制备 2-5ml质粒质粒DNA的大量制备的大量制备 500ml2细菌的收集u细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了提高质粒DNA的纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好用STE或生理盐水悬浮，漂洗l-2次，离心管壁上的液体也应该仔细去除干净 碱裂解法碱裂解

18、法 煮沸法煮沸法 SDSSDS裂解法裂解法 Triton-Triton-溶菌酶法溶菌酶法 3细菌的裂解方法方法4质粒DNA的提取- 适用于大质粒适用于大质粒DNA- 不适宜含糖高的菌株如不适宜含糖高的菌株如HB101二、煮沸裂解法二、煮沸裂解法三、三、SDS裂解法裂解法四、其他方法四、其他方法一、碱裂解法一、碱裂解法五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯化一、碱裂解法 在强碱（在强碱（pH12.0pH12.012.612.6）条件下，用）条件下，用SDSSDS破破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNADNA发生变性，释放出质粒发生变性，释放出质粒DN

19、ADNA。u细胞裂解后，细胞壁、细胞膜的碎片、变性细胞裂解后，细胞壁、细胞膜的碎片、变性的蛋白质和的蛋白质和染色体染色体DNADNA形成大的复合物形成大的复合物u当当pHpH调至中性，质粒调至中性，质粒DNADNA重新恢复天然的超螺重新恢复天然的超螺旋结构旋结构u在高盐条件下沉淀，经离心分离，在高盐条件下沉淀，经离心分离，质粒质粒DNADNA保保留在上清液中留在上清液中二、煮沸裂解法 将细菌悬浮于含将细菌悬浮于含TritonX-100TritonX-100和溶菌酶和溶菌酶的缓的缓冲液中，冲液中，TritonX-100TritonX-100和溶菌酶能破坏细胞壁，和溶菌酶能破坏细胞壁，再用沸水浴裂

20、解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与再用沸水浴裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与DNADNA变性。变性。u质粒质粒DNADNA因结构紧密不会解链，当温度下降因结构紧密不会解链，当温度下降后，可重新恢复其天然超螺旋结构后，可重新恢复其天然超螺旋结构u通过离心去除变性的蛋白质和染色体通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA, DNA, 然后回收上清液中的质粒然后回收上清液中的质粒DNADNA三、SDS裂解法u将细菌悬浮于等渗的将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液蔗糖溶液中，用中，用溶菌酶和溶菌酶和EDTAEDTA处理以破坏细胞壁处理以破坏细胞壁u用用SDSSDS裂解去壁细胞，温和释放质粒到等渗液中裂解去壁细胞，温和释

21、放质粒到等渗液中u用酚用酚/ /氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNADNA 由于条件温和，由于条件温和， SDSSDS裂解法裂解法特别适用于特别适用于大大质粒质粒DNADNA（15kb15kb）的提取。但由于部分质粒）的提取。但由于部分质粒DNADNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。不高。四、其他方法（二）牙签少量制备法（二）牙签少量制备法( (一一) ) 小量一步提取法小量一步提取法( (一一) ) 小量一步提取法小量一步提取法u直接将酚直接将酚/ /氯仿与细菌培养物混合，然后离心去氯仿与细菌培养物混合，然后离心去除大部

22、分蛋白质和染色体除大部分蛋白质和染色体DNADNA，最后从上清液中，最后从上清液中回收质粒回收质粒DNADNAu简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限制性内简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析切酶图谱分析（二）牙签少量制备法（二）牙签少量制备法u用牙签直接挑取生长在琼脂用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落平板上的细菌菌落制备质粒制备质粒DNADNAu由于制备的质粒由于制备的质粒DNADNA有较多污染，不能用于分子有较多污染，不能用于分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定五、质粒DNA的纯化.CsCl-EB.CsCl-EB法法. .聚乙二

23、醇沉淀法聚乙二醇沉淀法. .柱层析法柱层析法 在过量在过量EBEB存在的条件下，各种不同密度的物质存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。经离心平衡后得以分开。u蛋白质由于密度小而浮于液面蛋白质由于密度小而浮于液面uRNARNA密度大而沉于管底密度大而沉于管底u各种各种DNADNA密度介于蛋白质与密度介于蛋白质与RNARNA之间，处于中部之间，处于中部 EB-CsCl密度梯度离心法 不同分子构型的不同分子构型的DNADNA与与EBEB的结合能力不同，密的结合能力不同，密度下降也不同，因而可将它们有效分离开。度下降也不同，因而可将它们有效分离开。 u染色体染色体DNADNA、开环质

24、粒、开环质粒DNADNA等可嵌入更多的等可嵌入更多的EBEB，因，因而密度下降较多而密度下降较多 u闭环质粒闭环质粒DNADNA为超螺旋三级结构，为超螺旋三级结构，EBEB不易插入而不易插入而结合量少，密度下降较少结合量少，密度下降较少 第四节 真核细胞RNA的分离纯化细胞RNA的含量每个细胞的RNA量约为10-5 g 80%-85% rRNA 10%-15% tRNA 1%-5% mRNA 其他RNA：hnRNA、 snRNA 、snoRNA二、酸性异硫氰酸胍二、酸性异硫氰酸胍- -酚酚- -氯仿一步法氯仿一步法三、商品化试剂单相裂解法三、商品化试剂单相裂解法四、四、mRNAmRNA的分离纯

25、化的分离纯化一、一、RNARNA制备的条件与环境制备的条件与环境一、RNA制备的条件与环境uRNARNA易被易被RNaseRNase水解，水解，RNaseRNase除细胞内还广泛存在除细胞内还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中uRNaseRNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非常分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定，去除变性剂后，稳定，去除变性剂后，RNaseRNase的活性又可恢复的活性又可恢复u去除去除RNaseRNase的污染和抑制其活性是的污染和抑制其活性是RNARNA制备制备成功与否的关键成功与否的关键u在总在总RNARNA提取分

26、离的最初阶段，尽可能地提取分离的最初阶段，尽可能地灭活细胞内灭活细胞内RNaseRNase的活性的活性 u选择性地使用选择性地使用RNaseRNase的变性剂的变性剂（如酚、氯仿（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）及强烈的胍类变性剂）u使用使用蛋白酶蛋白酶K K u使用阴离子去污剂如使用阴离子去污剂如SDSSDS、十二烷基肌氨酸十二烷基肌氨酸钠钠或脱氧胆酸钠或脱氧胆酸钠u联合使用联合使用RNaseRNase的特异抑制剂（如的特异抑制剂（如RNasinRNasin与与DEPCDEPC等）能极大地防止内源性等）能极大地防止内源性RNaseRNase对对RNARNA的降解的降解u加入加入-巯基乙醇、二硫

27、苏糖醇（巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTTDTT）等还原剂）等还原剂可以还原可以还原RNaseRNase中的二硫键，有利于中的二硫键，有利于RNaseRNase的变性、的变性、水解与灭活水解与灭活二、酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法u以含异硫氰酸胍、以含异硫氰酸胍、-疏基乙醇和十二烷基肌疏基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的氨酸钠的变性溶液变性溶液裂解细胞裂解细胞u在在pH4.0pH4.0的条件下，酚的条件下，酚/ /氯仿抽提细胞氯仿抽提细胞裂解溶裂解溶液液u通过异丙醇沉淀与通过异丙醇沉淀与75%75%的乙醇洗涤而获得总的乙醇洗涤而获得总RNARNA 总总RNARNA产量取决于标本的起始量，产量取决于标本的起始量，每每mgmg组组织大约能制备织大约能制备4 47 7 g g总总RNARNA，每，每10106 6个细胞大约个细胞大约能制备能制备4 41010 g g总总RNARNA。 三、商品化试剂单相裂解法u是异硫氰酸胍是异硫氰酸胍- -酚酚- -氯仿一步法的改进方案氯仿一步法的改进方案u以以异硫氰酸胍异硫氰酸胍- -酚酚的单相裂解液裂解细胞，再的单相裂解液裂解细胞，再加入加入氯仿氯仿后形成两相后形成两相u变性的变性的DNADNA与蛋白质介于两相的交界面，