蛋白质分离纯化与鉴定—综合性实验

1、蛋白质分离纯化与鉴定综合性实验三峡大学医学院生物化学教研室三峡大学医学院生物化学教研室1、从血清获得高纯度的白蛋白、从血清获得高纯度的白蛋白2、掌握蛋白质盐析、掌握蛋白质盐析、 G-25葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐、DEAE-纤维素离子交换层析、纤维素离子交换层析、 SDS-PAGE电电泳的原理与实验操作技术泳的原理与实验操作技术3、掌握考马斯亮蓝、掌握考马斯亮蓝G250染色法定量检测蛋白质染色法定量检测蛋白质的原理和操作方法的原理和操作方法4、了解紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪、了解紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪、恒压高位槽的原理与使用方法、恒压高位槽的原理与使用方法实验目的

2、实验流程蛋白质盐析蛋白质盐析葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶-25-25（脱盐）（脱盐）DEAE-Cellulose离子交换（纯化）离子交换（纯化）蛋白质浓度检测蛋白质浓度检测SDS-PAGE电泳法电泳法 （鉴定蛋白质纯度）（鉴定蛋白质纯度）柱层析实验装置UV monitorRecorderFraction CollectorColumnBufferReservoir柱层析实验仪器一：HD-3紫外检测仪波长波长光量光量灵敏度灵敏度电源电源调零调零根据光吸收原理设计，光源为紫外光，可监测具有根据光吸收原理设计，光源为紫外光，可监测具有紫外吸收物质紫外吸收物质(蛋白质、核酸、多肽、酶蛋白质、核酸、多肽、酶)的

3、检测仪器，的检测仪器，与层析柱、部份收集器及记录仪配套，组成一个完整的与层析柱、部份收集器及记录仪配套，组成一个完整的液相色谱分离分析装置。液相色谱分离分析装置。p构造和功能构造和功能1. 1. 检查检查：连接是否正确，将：连接是否正确，将“波长波长”旋钮旋到所需波长刻度；旋钮旋到所需波长刻度；2. 2. 预热预热：按下：按下 “ “电源电源”开关，电源指示灯亮；开关，电源指示灯亮；3. 3. 调调100%100%：把：把“灵敏度灵敏度”旋钮选择到旋钮选择到“100100”档，调节档，调节“光量光量”旋钮，数字显示为旋钮，数字显示为100100，即透光率为，即透光率为100100；4. 4.

4、调零调零：把：把“灵敏度灵敏度” ” 旋到所需档（使用者自行掌握），缓慢调旋到所需档（使用者自行掌握），缓慢调节节“调零调零”旋钮，数字显示为旋钮，数字显示为“0”0”。备注备注：以上步骤需反复调节几次。在样品检测过程中，不可再调：以上步骤需反复调节几次。在样品检测过程中，不可再调节节“调零调零”、“光量光量”旋钮旋钮。如绘出的图谱即出峰过小，可改变如绘出的图谱即出峰过小，可改变“灵敏度灵敏度”选择档，每档成两倍放大关系。选择档，每档成两倍放大关系。p使用方法使用方法柱层析实验仪器二：BSZ-100自动部份收集器p构造和功能构造和功能选择选择置数置数手手/自动自动切换切换复位复位按照设定的时间

5、自动收集样品按照设定的时间自动收集样品p使用方法使用方法1. 1. 准备准备：检查检查“漏液报警板漏液报警板”、试管插在收集架上试管插在收集架上；2 2. . 定位定位：按按“复位复位”键键，“报警报警”后，再按后，再按“复位复位”键，仪器自键，仪器自动复位动复位；把安全阀上横杆一头的硅胶管对准第一根试管位置，固把安全阀上横杆一头的硅胶管对准第一根试管位置，固定好螺钉定好螺钉；3 3. . 定时定时：按按 “手动手动/ /自动自动”键，仪器键，仪器为为 手动手动 状态状态，按按“选择选择”键键选定位置，选定位置，按按“置数置数”键设置时间，再按键设置时间，再按“选择选择”键键确定；确定；4 4

6、. . 自动收集自动收集：按按“切换切换”键，键，“收集收集”指示灯亮，仪器指示灯亮，仪器为为 收集收集 状状态态；按按“手动手动/ /自动自动”键，仪器键，仪器为为 自动收集自动收集 状态状态；5 5. . 停止收集停止收集：或：或按按“手手/ /自动自动”键，仪器键，仪器为为 手动手动 状态状态或或关电源。关电源。柱层析实验仪器三：LM17型记录仪p构造和功能构造和功能抬抬/落笔手柄落笔手柄量程显示量程显示调纸速调纸速纸速启停纸速启停纸速显示纸速显示电源电源量程量程/零位切换键零位切换键当样品流过检测仪时，记录仪即可绘出洗脱图谱当样品流过检测仪时，记录仪即可绘出洗脱图谱p使用方法使用方法1

7、. 1. 打开打开：按：按“电源电源” ；2. 2. 调零调零：按：按“量程量程/ /零位零位” ” 键，零位指示灯亮，数码管显示键，零位指示灯亮，数码管显示“Po”“Po”，按，按 左移左移 或或 右移右移 键，使记录笔移至键，使记录笔移至所需所需零位零位；3. 3. 选择量程选择量程：按：按“量程量程/ /零位零位” ” 键，量程指示灯亮，数码管显示当键，量程指示灯亮，数码管显示当前量程范围前量程范围，按按 增加增加 或或 减少减少 键，键，使使量程为量程为10mV10mV；4. 4. 调调纸速纸速：按：按“启启/ /停停”键键，“纸速显示纸速显示” 闪烁，按闪烁，按“调速调速”键调键调节

8、纸速节纸速，确定后按确定后按“启启/ /停停”键键；5. 5. 记录记录：取下记录笔的塑料笔套，压下取下记录笔的塑料笔套，压下“抬抬/ /落笔手柄落笔手柄”；实验原理一：盐析盐析盐析salting out高浓度的中性盐可以中和蛋白质表面电荷、夺取高浓度的中性盐可以中和蛋白质表面电荷、夺取蛋白质周围的水化膜，破坏蛋白质在水溶液中的稳定蛋白质周围的水化膜，破坏蛋白质在水溶液中的稳定性，从而将蛋白质从溶液中析出。性，从而将蛋白质从溶液中析出。常用中性盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等常用中性盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等+水化膜水化膜实验操作一：盐析0.5ml Serum0.5ml s(NH4)2SO4Mi

9、x5000rpm/10min SupernatantPrecipitate上清转至另一上清转至另一Ep管备用；管备用；沉淀沉淀0.5ml dH2O，离心，留上清液备用。，离心，留上清液备用。(白蛋白蛋白和球蛋白分别留白和球蛋白分别留200ul用于电泳上样用于电泳上样)实验原理二：凝胶层析Sephadex structure (Left: molecule; Right: model)凝胶过滤凝胶过滤gel filtrationTable. Physical Characteristics of Polydextran GelsDesignationSephadex G10Sephadex G2

10、5Sephadex G50Fractionation Range(MW)7001,000-5,0001,500-30,000DesignationSephadex G100Sephadex G150Sephadex G200Fractionation Range(MW)4,000-150,0005,000-400,0005,000-800,000 实验操作二： G-25葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐1. 平衡平衡:0.02mol/LNH4Ac缓冲液平衡缓冲液平衡G-25柱，紫外检测柱，紫外检测仪、记录仪基线稳定仪、记录仪基线稳定;2. 上样上样:取下柱上端套塞，当柱上液面与凝胶床面相切，

11、取下柱上端套塞，当柱上液面与凝胶床面相切，立即将样品小心而缓慢地加到柱床表面立即将样品小心而缓慢地加到柱床表面;3.洗涤洗涤:样品降至床面，用样品降至床面，用0.02mol/LNH4Ac洗涤柱壁洗涤柱壁1次次;4. 收集收集:将将0.02mol/LNH4Ac缓冲液充满层析柱，与高位缓冲液充满层析柱，与高位恒压槽连通，同时开启自动部分收集器进行收集；恒压槽连通，同时开启自动部分收集器进行收集；5. 再次平衡再次平衡:继续用继续用0.02mol/LNH4Ac流洗直到记录仪基流洗直到记录仪基线恢复到零。线恢复到零。 实验原理三：DEAE-Cellulose离子交换层析离子交换层析离子交换层析ion

12、exchange chromatography低盐洗脱液低盐洗脱液高盐洗脱液高盐洗脱液混合蛋白质混合蛋白质实验操作三：纯化1. 平衡平衡:0.02mol/LNH4Ac缓冲液平衡离子交换柱，紫外缓冲液平衡离子交换柱，紫外检测仪、记录仪基线稳定检测仪、记录仪基线稳定;2. 上样上样:取下柱上端套塞，当柱上液面与凝胶床面相切，取下柱上端套塞，当柱上液面与凝胶床面相切，立即将样品小心而缓慢地加到柱床表面立即将样品小心而缓慢地加到柱床表面;3.洗涤洗涤:样品降至床面，用样品降至床面，用0.02mol/LNH4Ac洗涤柱壁洗涤柱壁1次次;4. 收集收集-球蛋白球蛋白:将将0.02mol/LNH4Ac缓冲液

13、充满层析柱，缓冲液充满层析柱，与高位恒压槽连通，开启自动部分收集器进行收集；与高位恒压槽连通，开启自动部分收集器进行收集；5. 洗涤其他球蛋白洗涤其他球蛋白:记录仪基线恢复到零后记录仪基线恢复到零后,用用0.06mol/L NH4Ac流洗，不用进行收集流洗，不用进行收集实验操作三：纯化6.收集白蛋白收集白蛋白:待记录仪基线恢复到零后，用待记录仪基线恢复到零后，用0.3mol/L NH4Ac缓冲液流洗，自动部分收集器进行收集缓冲液流洗，自动部分收集器进行收集;7. 柱上再生柱上再生:待待记录仪基线恢复到零后记录仪基线恢复到零后,用用1.5mol/LNaCl- 0.3mol/LNH4Ac流洗，不用

14、进行收集流洗，不用进行收集;8. 再次平衡再次平衡:待记录仪基线恢复到零后，用待记录仪基线恢复到零后，用0.02mol/L NH4Ac流洗流洗1-2个柱体积个柱体积实验原理四：蛋白质定量 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250 Coomassie brillient blue在一定浓在一定浓度乙醇和酸性溶液中呈现红色。此条件下，考马斯亮度乙醇和酸性溶液中呈现红色。此条件下，考马斯亮蓝蓝G250可以与蛋白质结合，颜色从红色变为蓝色，最可以与蛋白质结合，颜色从红色变为蓝色，最大吸收峰从大吸收峰从465nm移至移至595nm。考马斯亮蓝。考马斯亮蓝G250与蛋白与蛋白质的复合物在质的复合物在595nm波长处具

15、有很高的光吸收系数，波长处具有很高的光吸收系数，并与溶液中的蛋白质浓度呈正比。利用这一性质可以并与溶液中的蛋白质浓度呈正比。利用这一性质可以定量测定蛋白质的浓度。定量测定蛋白质的浓度。考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250染色法：染色法：优点：与凯氏法及优点：与凯氏法及Lowry法相比操作简便，能同时法相比操作简便，能同时测定多个样品；敏感度高于测定多个样品；敏感度高于Lowry法；复合物颜色法；复合物颜色稳定；对干扰剂无稳定；对干扰剂无Lowry法及紫外吸收法那样敏感。法及紫外吸收法那样敏感。缺点：有时会有非特异性吸附，同等量的不同种类缺点：有时会有非特异性吸附，同等量的不同种类蛋白质测定值之间可能会

16、有较大的偏差；要求样品完蛋白质测定值之间可能会有较大的偏差；要求样品完全溶解；样品不能回收使用；高浓度的全溶解；样品不能回收使用；高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去垢剂等对测定、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去垢剂等对测定有干扰作用。有干扰作用。 实验操作四：蛋白质定量充分混匀后以充分混匀后以1管调零，在管调零，在595nm处测定各管吸处测定各管吸光度。然后以蛋白质浓度为横坐标，吸光度光度。然后以蛋白质浓度为横坐标，吸光度An作纵作纵坐标，绘制标准曲线。在标准曲线上查出检测管吸坐标，绘制标准曲线。在标准曲线上查出检测管吸光度对应的蛋白质浓度。光度对应的蛋白质浓度。

17、1mg/mL标准标准白蛋白白蛋白（l）蒸馏水（蒸馏水（l ）考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250（ml）1234567测定测定33333330.030.0样品样品546 4848 12 24 36 12 24 36 06036003实验原理五：SDS-PAGE电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE SDS polyacrylamide gel electrophoresisSDSSDS带负电荷，破坏蛋白质的氢带负电荷，破坏蛋白质的氢键、疏水键，使之形成单个亚基。键、疏水键，使之形成单个亚基。SDS-SDS-蛋白质复合物为雪茄形的蛋白质复合物为雪茄形的长椭圆棒长椭圆棒，消除或掩

18、盖了不同种消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异类蛋白质间原有电荷的差异。SDSSDS - -蛋白质复合物在凝胶电泳蛋白质复合物在凝胶电泳中的中的迁移迁移率只是蛋白质分子量的率只是蛋白质分子量的函数有关函数有关。 上上电极缓冲液电极缓冲液下下电极缓冲液电极缓冲液样品槽样品槽上样器上样器阴极阴极阳极阳极电泳电泳方向方向聚丙烯酰胺凝胶板聚丙烯酰胺凝胶板实验原理五：SDS-PAGE电泳实验操作五：SDS-PAGE电泳1. 制胶：制胶： 试剂试剂 分离胶（分离胶（ml） 浓缩胶（浓缩胶（ml） 1.5M Tris-HCl （pH 8.9） 2.50 30%单体单体 3.50 1.00 10%SDS 0.10 0.10 蒸馏水蒸馏水 3.84 6.340.5M Tris-HCl （pH 6.8） 2.5010%过硫酸铵过硫酸铵AP 0.05 0.05四甲基乙二胺四甲基乙二胺TEMED 0.01 0.012. 样品处理：样品处理：Loading buffer40%甘油甘油溴酚兰溴酚兰SDS-巯基乙醇巯基乙醇0.5M Tris-HCl（pH 6.8）50ul样品样品50ul(2)Loading buffer M