白脉散有效成分组调控神经干细胞增殖实验探究

1、白脉散有效成分组调控神经干细胞增殖实验探究摘要神经干细胞(nscs)具有替代及修复受损神 经组织的作用，研究发现能够通过调控nscs内环境诱导其 增殖分化，重塑神经功能，从而修复脑卒中神经病变等神经 系统损伤。本实验研究了蒙药白脉散有效成分组(bmecg) 激活nscs增殖的药理学作用。通过建立体内外2种损伤模 型，模拟脑卒中神经病变，分别利用流式细胞术、行为学检 测、nestin免疫组化等方法研究bmecg的脑保护作用机制。 结果表明，bmecg能够显著提高体外培养nscs增殖能力，有 助于小鼠的行为学功能恢复，明显改善模型小鼠大脑皮层 nscs增殖能力。因此bmecg直接针对nscs增殖存

2、活能力发 挥作用，可能是治疗脑卒中神经病变的机制之一，该药物具 有重要的研究意义和广阔的应用前景。关键词白脉散；有效成分组；神经干细胞；脑卒中; 竣基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯染色法收稿日期2013-04-18基金项目国家自然科学基金面上项目(81173657) 通信作者*陈小玉，e-mail： xiaoyu0767163、com作者简介刘庆山，tel/fax： (010)68933254, e-mail：nlqsh163> com “有效成分组"是指复方中与治疗目的密 切相关的活性成分的总和，是传统复方现代化的重要指导理 论之一 1。白脉散有效成分组（baimai effec

3、tive compounds group, bmecg）是课题组在“复方有效成分组" 理论指导下从蒙药经典方剂白脉散中获得的“组分中药”， 由人参皂昔血1、胡黄连昔ii、牛磺酸等组成，成分清楚， 质量可控2-3 o白脉散源自四部医典，临床可用于治疗 白脉病等病症4,为发挥民族药大复方多组分、多靶点的 特点，对其有效成分进行深入研究，研究bmecg对脑卒中神 经病变的作用和机制，本研究釆用体外实验及整体实验，对 bmecg影响nscs的作用进行了研究。1材料1、1动物一日龄wistar大鼠，spf级，购自北京维通利华有限公 司，许可证号scxk （京）2006-0008；健康雄性昆明小

4、鼠， spf级，体重（20±2） g,购自北京维通利华有限公司，许 可证号 scxk （京）2009-0017o1、2药品人参皂昔rgl（纯度98%,昆明双星科技开发有限公司）, 胡黄连昔ii （纯度90%,南京景竹生物科技公司），白脉散有 效成分组为本实验室自制，由人参皂昔rgl、没食子酸、胡 黄连昔ii、牛磺酸等成分按照质量百分比33%, 30%, 33%, 4%组成。1、3试剂胎牛血清（澳大利亚进口，浙江天航生物科技有限公司 分装）；dmem/f12培养基、神经干细胞培养添加剂b27 （gibco 公司）；重组牛碱性成纤维生长因子bfgf （珠海亿胜生物制 药有限公司）;map

5、-2兔抗鼠一抗、nest in兔抗鼠一抗（sigma 公司）；cfda-se试剂盒（碧云天生物技术研究所）；fitc标 记山羊抗兔二抗（北京中衫金桥生物技术有限公司）；dab显 色试剂盒、mayor苏木素（武汉博士德生物工程有限公司）； 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔igg （碧云天生物技术研究 所）；其余试剂均为市售分析纯。1、4仪器zb-200平衡转棒仪（成都泰盟软件有限公司）；超净工 作台（北京医疗设备厂）；cb150二氧化碳培养箱（德国 binder）； heracell 150 三气培养箱（美国 thermo 公司）； 流式细胞仪（facscalibur, bd公司，美国）；1x81自动

6、型 倒置荧光显微镜（日本0lympus公司）；5804r型低速冷冻离 心机（德国艾本德公司）。2方法2、1体外nscs氧糖剥夺/复供增殖模型的制备2、1、1原代培养大鼠nscs取一日龄新生大鼠，以75% 乙醇浸泡灭菌，置于无菌工作台中冰上操作。取出大脑皮层 置于4 °cpbs中，剥离血管和脑膜后置于小西林瓶中加2 ml 培养基剪成泥状，用吹打法分散细胞，200目钢筛过滤。1 000 r min-1离心5 min,弃上清，加入dmem/f12完全培养基 （含 bfgf 50 ug - l-l, 2%b27）,吹打成细胞悬液。0、4% 台盼蓝计数，调整细胞密度，按5x105个/ml接种于

7、25 cm2 细胞培养瓶中。置于37 °c, 5%co2培养箱中悬浮培养，待 nscs形成克隆球后适时传代5。首先利用nscs特异性表面 标记物巢蛋白（nestin）按常规免疫荧光实验方法进行鉴定。 给药后每天选取6个不同视野，在倒置显微镜下拍照，最后 应用image-pro-plus 6、0软件进行处理，观察克隆球数目 变化及直径计算其增殖能力。培养34 d后，培养基中可见桑套样的细胞克隆聚集 物，直径多为70 urn左右，折光性强，细胞边界清楚。培 养至第5天，克隆球的数量、直径均有明显增加，由数百个 细胞组成，形态较规则，平均直径约为100 pmo常规培养 至第7天，可见大量n

8、scs典型的克隆球形成，直径增加至 126 uni左右，呈球形悬浮生长。传代3次后经免疫荧光染 色显示各克隆球内细胞呈nestin强阳性，无神经元和神经 胶质细胞nse和gfap的特异性荧光表现（图1）。结果显示 所培养的nscs具有显著的自我更新增殖能力，且表达干细 胞特性。a、大鼠神经干细胞常规培养第7天（x200）； b、第3 代传代克隆球（x400）； c、神经干细胞克隆球nestin染色（免疫荧光染色，x400）o图1体外培养大鼠神经干细胞fig、 1 primary cultured rat neural stem cellsnscs诱导分化24h后可见绝大多数nscs贴壁生长。第

9、 7天可见细胞均匀分布于孔板中，单层生长，呈现神经元样 或胶质细胞样形态。免疫荧光染色后显示map-2阳性可见， 也就表明所培养的nscs具有分化为神经元的能力（图2）。 综上所述，本实验体外培养大鼠nscs显示神经干细胞特异 性标记物，且具有自我更新能力及分化为神经元的潜能，可 用于药物实验研究。a、神经干细胞克隆球贴壁诱导分化第1天（x200）； b、神经干细胞克隆球诱导分化第3 天，图中平铺的为神经元及胶质细胞（x100）； c、神经干 细胞克隆球诱导分化为神经元map-2染色，fitc标记 （x100）o图2体外培养神经干细胞诱导分化fig、2 primary cultured rat

10、 neural stem cells after fetal bovine serum culture2、1、2体外nscs缺糖缺氧/复氧模型建立和分组大 鼠nscs以1x106个/ml接种于96孔无菌培养板中，培养第 2天细胞贴壁且未发生分化时用于实验，分为空白对照组、 模型组、阳性药组（rgl 20 mg - l-1 - d-1）. bmecg高、中、 低剂量组（50, 25, 12、5 mg l-1 d-1）。除空白对照组 外均进行缺氧后再复氧处理：三气培养箱预先通入氮气，将 氧含量降至1%,培养细胞吸出原培养基，每孔加入50 pl 无糖earle/ s平衡盐溶液代替培养基，放入三气培养

11、箱中 缺氧培养6 h,取出后换以神经干细胞完全培养基，常规培 养24 h后进行检测。空白对照组进行常规培养，在制备模 型时同步换以含2%b27和50 ng bfgf的earle' s液。2、1、3 cfda-se标记及检测 以1 u l cfda-se细胞标 记含有1%bsa的培养液中的离散的单细胞悬液1x107个 /ml,在37 °c孵箱内孵育15 min,再用无血清培养基清洗2 次，计数后调整细胞到1 x106个/ml在96孔板中进行正常 培养，整个过程避光操作。nscs的增殖周期的平均时间为 （22、8±1、0） h6-7,因此本研究选取染色后第1, 3, 7

12、天作为观测时间点。流式细胞仪用于检测分析，取出1孔 细胞（500 pl）检测分裂峰调整密度1x105个/ml,每组 上样500 plo单次检测样品为5 000个细胞，各子代增殖 百分比等数据由modfit软件进行分析得到。2、2 bmecg对在体脑缺血复供小鼠模型的干预2、2、1小鼠全脑缺血模型的建立及分组采用双侧颈 总动脉夹闭法 （bilateral carotid artery occlusion, bca0）建立昆明小鼠全脑缺血再灌注模型8-9 o小鼠适应 性饲养3d,自由饮食，80只小鼠随机分为假手术组（sham）、 模型组（model）、阳性药组（人参皂昔rgl,20 mg kg-1

13、d-1)、bmecg 高、中、低剂量组(100, 50, 25 mg - kgld-1),每组12只，剩余8只随时补充试验中死亡小鼠。10%水合氯醛(350 mg - kg-1)腹腔注射麻醉后小鼠仰位固定于动物操作台上，沿颈前正中切口，露双侧颈总动脉(bilateral common carotid artery, bcca), 分离伴行 的迷走神经，在颈总动脉下方穿入一 4号手术线，然后拉起手术线用无创微动脉夹夹闭双侧颈总动脉30 min后，松开 动脉夹，恢复供血进行再灌，缝合切口。假手术组亦进行麻 醉及分离颈总动脉操作，但不夹闭bccao各组小鼠造模后给 药。2、2、2小鼠平衡转棒仪测试

14、采用小鼠平衡转棒仪观 察小鼠的运动协调能力、平衡能力以及肌肉松弛程度并进行 模型建立成功与否的检测10 o本实验选取转棒直径30 mm, 转速设定为030 s内加速至30 r min-1,检测时间为90s,转棒底部为记录接触板。每只小鼠测试3次，取平均值。 将大鼠放置在转棒上，然后开启转棒仪，小鼠随着转棒的转 动在棒上爬行，当小鼠自行掉落后红外线感应装置自动记录 在棒时间。手术前3 d开始训练，每天分早、中、晚训练3 次，并对在棒时间进行记录，给药第7, 14天进行平衡转棒仪检测。2、2、3 bmecg对全脑缺血复供模型小鼠病理学影响小鼠造模术后给药第7天，每组随机取6只小鼠观测组织病理 变化

15、。具体方法如下：用10%水合氯醛腹腔麻醉后经4%多聚 甲醛心脏灌流断头取脑，石蜡包埋，制作大脑冠状石蜡切片 （厚度为4 um）,常规he染色，光镜下观察组织形态学变 化。2、2、4 nestin免疫组化（dab法）检测 采用2、2、3 项中大脑石蜡切片经二甲苯脱蜡至水，常规免疫组化法进行 nestin染色，结果在显微镜下观察。每只小鼠取3张连续切 片，每张切片在400倍光镜下选取上、下、左、右、中5个 视野，在拍摄条件相同的条件下拍照，并利用image pro plus 6、0图像处理系统分析视野阳性表达，平均吸光度二累积吸 光度（i0d） /总面积（area）,取9个视野平均值。2、3数据统

16、计 数据以土s表示，采用spss 12、0统计 软件处理，组间比较采用方差齐性检验，后利用单因素方差 分析，p 3、1、2 bmecg对体外培养nscs增殖能力影 响cfse标记的nscs荧光强度随着模型的建立以及药物的作 用而变化。造模后第3天，模型组细胞增殖分裂能力明显减 低，与空白组存在差异（pbmecg作为在有效成分组理论指导下获得的民族药的组分药物16,除保留了民族药大 复方多组分、多靶点的特点，还具有成分清楚，利于质量控 制等优点。目前，已有学者利用快速制备技术和活性组分快 速筛选等方法对bmecg的抗脑卒中作用进行研究。虽然证明 其具有清除自由基，减轻脑缺血再灌注所导致的氧化性损

17、伤 等作用2-4,但对于bmecg对nscs增能、迁移能力的影 响却知之甚少。因此以bmecg对体内外nscs的调控为切入 点，研究其治疗脑卒中神经病变药理活性有重要意义。本研究结果显示bmecg显著提高了体外培养nscs增殖 能力，提高了在体nscs的增殖活性。通过nestin免疫组化、 实验动物的死亡率、脑水肿及动物行为学检测结果证实在脑 缺血7 d时，bmecg促进脑内nscs增殖、减低缺血再灌注导 致的神经系统损伤。提示bmecg可能通过提高nscs自我更 新能力来对抗脑缺血后神经元的缺失，进而发挥中枢神经保 护活性。本研究中不同浓度相同剂量的bmecg引起的nscs 增殖能力变化具有

18、显著性差别，其中体内、外促nscs增殖 能力以及在行为测试均显示中剂量作用最为明显，较阳性药 具有更强的促nscs增殖能力。此结果的产生可能是由于在 剂量选择时没有达到最佳浓度，仅在药理作用上得到了阳性 结果，此外也可能由于检测时间点的选择导致的。实验结果 说明bmecg的促nscs增殖作用与浓度有一定相关性，但较 高剂量的bmecg促增殖作用较中剂量有所减低，可能与检测 时间点的选择有一定的关系。随着时间的变化，和药物浓度 的不同，药物调控nscs向增殖和分化两个方向进行，而本 实验中bmecg高剂量组可能在发挥促增殖作用的同时也调控 nscs分化为神经元等功能细胞，导致结果较中剂量组显著性

19、 降低。因此本实验中时间点较为单一，并未达到长期动态监 测的目标，也可能是导致剂量依赖性不明显地一个结果。尽 管本研究对bmecg影响nscs分化、迁移作用的影响没有深 入研究，但实验结果表明药物可能在损伤部位起效从而达到 治疗中枢神经病变及其后遗症的作用。此外，尽管本实验为 bemcg的临床应用促nscs增殖提供了一定依据，但其机制及 其他作用方面的未深入研究，bmecg对抗脑卒中神经病变的 治疗将进一步完善。综上所述，bmecg仍处于探索阶段，仍 有诸如nscs增殖调控分子机制，是否影响nscs分化、迁移 能力等许多问题有待解决。本实验为该药物的进一步研究提 供了研究基础，为bmecg治疗

20、缺血性脑卒中的等疾病补充了 科学依据。参考文献1杜冠华、中药复方有效成分组学研究门、中成药,2002,24 (11)：878、2张梓倩、蒙药白脉散组分库的建立和神经保护有 效成分组的研究d、北京：中央民族大学，中国少数民 族传统医学研究院，2011、3刘庆山，方亮，王维群，等，基于神经血管单元和网络药理学理论的抗脑卒中神经病变靶点分析j、中国 中药杂志，2012,37 (2)：138、4奇玲，罗达尚、中国少数民族传统医药大系m、 呼和浩特：内蒙古科学技术出版社，2000： 304、5 frank-peter wachssebastiencoui1lard-despres, maren enge

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28、hospital,china)abstract the neuralstem cells(nscs), play acrucial role in stroketreatment ,which can bechinese medicines、the proliferation of nscs has beeninvestigated、theregulated by a few of traditionalin this study, the effect of the mongolian medicinebaimai powder effective compounds group (bmecg) oncultured nscs which were isolated from newborn ratcerebral cortical in vitro were exposed to oxygen glucose deprivation/reoxgenation (ogd/r)、 the cfse immunofluorescence staining was employed to identif