免洗注射用冷冻干燥无菌粉末用氯化丁基橡胶塞微生物方法验证方案2013.04.26

1、免洗注射用冷冻干燥无菌粉末用氯化丁基橡胶塞抗生素瓶用铝塑组合盖微生物限度检查方法验证方案编码：VP/QBV-13-T102-00VP/QBV-13-T097-00页码：9 /7项目人员 ItemPersonnel部门/岗位Dept./Position签名Signature日期Date方案起草Prepared byQC/检验员年 月 日 (Y) (M) (D) QA/验证年 月 日 (Y) (M) (D) 方案审核Reviewed byQC/经理 年 月 日 (Y) (M) (D)QA/副经理 年 月 日 (Y) (M) (D)QA/经理年 月 日 (Y) (M) (D)方案批准Approved

2、 by质量受权人 年 月 日 (Y) (M) (D)颁发部门Issued byQA生效日期Effective Date 年 月 日 (Y) (M) (D)分发部门Distributed to QC制作备份：1份Copies prepared: 1pcs目 录1.概述32.目的33.依据及参考文件34.验证小组和各部门职责35.验证时间安排46.验证内容47. 偏差处理及变更控制6678.验证结果评价内容7附件1 ：培训确认1附件2：文件检查确认2附件3 ：设备确认结果3附件4 ：试验器材确认结果4附件5 ：试验用菌种确认结果4附件6：培养基确认结果555555附件7：试剂确认结果5附件8：器皿

3、确认结果6附件9：总菌落数计数验证结果记录7附件10：检验记录81. 概述免洗注射用冷冻干燥无菌粉末用氯化丁基橡胶塞是为本公司注射用粉针剂的重要包装材料，其生产均在洁净区域中完成，是。是确保注射用粉针剂产品质量的重要手段。免洗注射用冷冻干燥无菌粉末用氯化丁基橡胶塞是一种新型高洁净度的橡胶塞，其生产均在洁净区域中完成。现增加其微生物限度检查项，初拟的微生物限度标准为：总菌落数不得过20CFU/10个胶塞。初步拟定其检验方法为：取供试品10个，加入100 ml的0.9%无菌氯化钠溶液中，手工震摇1分钟，使胶塞与液体充分接触，制成供试液，将供试液用薄膜过滤器全部过滤，滤干后将滤膜菌面朝上贴于胰酪胨大

4、豆琼脂培养基平板上培养，平行制备2皿；。胰酪胨大豆琼脂培养基置2328培养箱倒置培养3天；，再转置3035培养箱倒置培养2天。抗生素瓶用铝塑组合盖是本公司注射剂的包装材料，规格有7.2mm、7.3 mm两种，来源：湖北银华药用包装材料有限公司。新建的206车间（粉针剂车间）轧盖操作选择在C级背景A级送风环境下进行，A级送风环境应当至少符合A级区的静态要求。为减少洁净区工序操作，现拟使用免消毒的铝塑组合盖用于生产，为避免铝塑组合盖对环境与产品质量的影响，需修订抗生素瓶用铝塑组合盖的质量标准，增加其微生物限度检查项，并同时进行微生物限度检查方法验证。A级区动态下表面微生物<1CFU/皿（55

5、mm的接触皿表面培养基面积约23.7cm2），而10个铝塑组合盖展开面积约94 cm2，约为1个接触皿面积的4倍，所以拟定抗生素瓶用铝塑组合盖的微生物限度标准为：总菌落数4CFU/不得过10个。20CFU/10个胶塞由于初拟的微生物限度检查采用铝塑组合盖浸渍洗脱法，实际采样面积远大于展开面积，所以本次拟定的质量标准较为严格，可用于铝塑组合盖的微生物控制。初步拟定其检验方法为：取供试品3010个，加入300 100 ml的0.9%无菌氯化钠溶液中，手工震荡震摇1分钟，使瓶盖与液体充分接触，制成供试液，取将供试液100ml，用薄膜过滤器全部过滤滤干，滤干后平行制备2张膜，将滤膜菌面朝上贴于胰酪胨大

6、豆琼脂培养基平板上培养，平行制备2皿，；同法制备2膜置沙氏葡萄糖琼脂培养基上。胰酪胨大豆琼脂培养基置置23302835倒置培养3天，培养结束后，转移至3035培养2天。；沙氏葡萄糖琼脂培养基置2025倒置培养5天。本次验证的抗生素瓶用铝塑组合盖使用的两个规格，其总表面积相差很小，分别约为31.1 cm2与31.3 cm2，根据库存情况选择三批（不分规格）抗生素瓶用铝塑组合盖进行三次独立验证。2.目的根据中国药典2010年版二部附录XI J“微生物限度检查法”确定拟定的立免洗注射用冷冻干燥无菌粉末用氯化丁基橡胶塞微生物限度检查方法是否适用。通过微生物方法学验证建立抗生素瓶用铝塑组合盖的微生物限度

7、检验标准操作规程。3.依据及参考文件3.1中国药典2010年版二部附录XI J“微生物限度检查法”3.2中国药品检验标准操作规范2010年版“微生物限度检查法”3.3现行版3欧盟药典*欧洲药典：非无菌产品微生物检测：微生物计数试验3.3药品GMP指南2011年版“无菌药品”3.4 SOP-QC-0213-V01微生物限度检查法3.5 SOP-QA-017-V02验证管理规程4.验证小组和各部门职责4.1验证小组及对应职责职位姓名部门具体职责组长谢圣坤QC验证总协调工作，并审核验证的数据组员许维雅朱利安QC负责验证方案和验证报告的起草，负责验证数据的收集，负责检品的检测与验证记录的填写。辛海安常

8、磊QC负责检品的检测与验证记录的填写。辛海安许维雅朱利安刘利李艳姣彭艳妃QC监督验证过程实施及验证过程中的偏差及OOS处理。吴东琴QA负责验证方案和验证报告的起草、归档保存。监督验证过程实施及验证过程中的偏差及OOS处理。4.2验证委员会姓名职务职责颜杰质量受权人1.负责验证方案及报告的批准；2.负责验证过程中出现的偏差/OOS的批准放行。马立如QA经理1.负责验证方案及报告的审核；2.负责验证过程中出现的偏差/OOS的评估。张德志QA副经理5.验证时间安排时 间工作内容2013年0304月方案起草、审批2013年03月04月至05月标准确认、检验方法确认2013年0405月完成报告6.验证内

9、容6.1验证前准备6.1.1培训确认本次验证内容是否已对相关人员进行培训，检查确认结果记录在附件1培训确认。6.1.2文件确认本次验证前验证方案及相关指导的SOP是否已经批准。检查确认结果记录在附件2文件检查确认。如无相关文件，则需要增加发放。6.1.3仪器设备确认检查所涉及的设备是否符合实验要求，确认结果填写在附件3 设备确认结果中。可接受标准：设备应经验证，在校准有效期内。6.1.4试验器材确认检查所涉用试验器材，确认结果填写在附件4试验器材确认结果中，可接受标准：试验器材各配件应齐全，无损坏。6.1.5试验用菌种确认检查所涉及的试验用菌种是否符合实验要求，确认结果填写在附件5 试验用菌种

10、确认结果中。可接受标准：菌种形态特征应良好、菌种代数不得超过第五代。6.1.6培养基确认检查所涉及的培养基是否符合实验要求，确认结果填写在附件6 培养基确认结果。可接受标准：培养基应在有效期内。6.1.7试剂确认检查所涉用试剂是否符合实验要求，确认结果填写在附件7试剂确认结果中。可接受标准：试剂应在有效期内。6.1.8器皿确认检查所涉用器皿是否符合实验要求。确认结果填写在附件8器皿确认记录中。可接受标准：一般玻璃器皿要求洁净，无破损，量器要进行校正。6.1.9验证用培养基、缓冲液、平皿、刻度吸管应置121湿热灭菌30分钟。，平皿、刻度吸管置200干热灭菌2小时。6.2验证方法6.2.1 菌液制

11、备：取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中经3035培养1824小时、，白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中经2328培养2448小时，分别加入0.9%无菌氯化钠溶液10ml洗下菌苔转移至空试管中作为菌悬液原液，用0.9%无菌氯化钠溶液进行10倍梯度稀释至含菌数50100cfu/ml的菌悬液。取黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中经2328培养57天，加入含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10ml洗下孢子吸出，转移至空试管中作为菌悬液原液，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液进行10倍梯度稀释

12、至含孢子数50100cfu/ml的孢子悬液。6.2.1 菌液制备：取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、大肠埃希菌铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌接种至胰酪胨大豆琼脂培养基中经3035培养1824小时的新鲜培养物；白色念珠菌接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基中经2025培养2448小时的新鲜培养物。上述培养物分别加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml洗下菌苔转移至空试管中作为菌悬液原液，用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液进行10倍梯度稀释至含菌数50100cfu/ml的菌悬液。取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中经3035培养1824小时、白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养

13、基中经2328培养2448小时，分别加入0.9%无菌氯化钠溶液10ml洗下菌苔转移至空试管中作为菌悬液原液，用0.9%无菌氯化钠溶液进行10倍梯度稀释至含菌数50100CFU/ml的菌悬液。取黑曲霉接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基中经2025培养57天的新鲜培养物，加入含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml洗下孢子吸出，转移至空试管中作为菌悬液原液，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液进行10倍梯度稀释至含孢子数50100cfu/ml的孢子悬液。取黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中经2328培养57天，加入含0.05%

14、（ml/ml）聚山梨酯的0.9%无菌氯化钠溶液10ml洗下孢子吸出，转移至空试管中作为菌悬液原液，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯的0.9%无菌氯化钠溶液进行10倍梯度稀释至含孢子数50100CFU/ml的孢子悬液。6.2.2菌液计数：分别取上述5种菌液1ml（50100cfu）加入培养皿，注入不超过45胰酪胨大豆琼脂培养基1520ml，每种菌液作平行2个平板，置2328培养箱倒置培养3天，培养3天后结束后，转移至3035培养箱培养2天，测定菌数。分别取上述黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌大肠埃希菌5种的菌液1ml（50100CFU）加入培养皿，注入不超过45胰酪胨大豆

15、琼脂培养基1520ml，每种菌液作平行2个平板，置23302835倒置培养3天，培养结束后，转移至3035培养2天，测定菌数。分别取白色念珠菌、黑曲霉的菌液1ml加入培养皿，注入不超过45oC沙氏葡萄糖琼脂培养基1520ml，每种试验菌平行制备2个平板，于2025倒置培养。6.2.3供试液制备：取供试品3010个，加入300 100 ml0.9%无菌氯化钠溶液中，手工震荡震摇1分钟，使瓶盖胶塞与液体充分接触，制成供试液。6.2.4总菌落数回收率测定：验证试验至少应进行3次独立批次（3批样品均不同批号）的平行试验，并计算各试验菌每次试验的回收率。要求回收率不低于为50%20070%。具体拟定方法

16、如下：6.2.4.1试验组：将1ml验证用菌液（含50100CFU试验菌）加入上述制备好的供试液中，混匀1分钟。先将20ml 0.9%无菌氯化钠溶液加入过滤器中，以润湿滤膜，。再取将含菌的供试液全部100ml和1ml验证用菌液（含50100CFU试验菌）加入薄膜过滤器内，滤干，每种菌平行制备2张膜，后将滤膜菌面朝上贴于胰酪胨大豆琼脂培养基平板上培养，每种菌平行制备2皿，置2328倒置培养3天，培养结束后，转移至3035培养2天，测定菌数。，置32033528培养箱倒置培养3天（必要时可以延长至5天），沙氏葡萄糖琼脂培养基再转置230235培养箱倒置培养52天（必要时可以将培养时间延长至7天）。

17、6.2.4.2菌液组：测定所加的试验菌数。6.2.4.3供试品对照组：制备方法同试验组，不加验证菌液。6.2.4.4稀释剂对照组：用在相应的稀释液中替代不加入供试品，其它按试验组的制备方法和菌落计数法测定菌数。试验结果：结果见总菌落数计数验证结果记录6.2.4.5结果判断：稀释剂对照组的菌回收率均应不低于70%。若试验组的菌回收率均不低于70%，则可按该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌或酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，采取加大冲洗量或其它方法重新验证。注：试验组回收率（%）=（试验组平均菌落数供试品对照组平均菌落数）÷菌液组平均菌落数×100

18、%稀释剂对照组回收率（%）= 稀释剂对照组平均菌落数÷菌液组平均菌落数×100%6.2.4.6结果统计 实验结果填写在总菌落数计数验证结果记录。7. 偏差处理及变更控制确认过程中如果有任何偏差应及时记录，分析原因，评价是否是重大偏差，并提出整改措施。偏差填写偏差处理单，并将偏差复印件附于确认报告中。确认过程中是否有变更，如有变更将变更再确认报告中进行说明。8.验证结果评价内容对验证结果进行综合评价，内容包括但不限于：确认实验是否有遗漏；确认验证过程中是否有偏差，偏差是否已经采取纠偏措施和预防措施；确认记录是否完整；是否需要进一步补充实验。评价必须以书面形式写出报告。免洗注射

19、用冷冻干燥无菌粉末用氯化丁基橡胶塞抗生素瓶用铝塑组合盖微生物限度检查方法验证编码：R/QBV-13-T102-00R/QBV-13-T096-00页码：12 / 8附件1 ：培训确认 培训确认培训人/日期培训对象部门职责签名谢圣坤彭艳妃QCQC验证总协调工作，并审核验证的数据监督验证过程实施及验证过程中的偏差及OOS处理。辛海安QC负责验证方案和验证报告的起草，负责验证数据的收集，负责检品的检测与验证记录的填写。常 磊QC负责检品的检测与验证记录的填写。朱利安许维雅QC刘利QC袁文静QC李艳姣QC吴东琴QA负责验证方案和验证报告的起草、归档保存。监督验证过程实施及验证过程中的偏差及OOS处理。

20、评价：确认人/日期： QA复核人/日期：附件2：文件检查确认文件检查确认文件名称文件编号是否已批准生测室管理规程SOP-QC-005-V02是 否培养基管理规程SOP-QC-017-V01是 否菌种管理规程SOP-QC-012-V02V03是 否QCXG1.D型脉动真空灭菌柜使用、维护标准操作规程SOP-QC-377-V00是 否培养箱使用和维护保养标准操作规程SOP-QC-303-V00V01是 否电子天平使用标准操作规程SOP-QC-317-V01是 否洁净工作台使用及维护保养标准操作规程SOP-QC-304-V00是 否生物安全柜使用、保养标准操作规程SOP-QC-0386-V00是 否

21、Haier 药品保存箱使用及保养标准操作规程QC冷藏冷冻设备使用、保养标准操作规程SOP-QC-0395357-V00是 否红外电热灭菌器使用、保养标准操作规程SOP-QC-0389-V00是 否评价：确认人/日期： QA复核人/日期： 附件3 ：设备确认结果设备确认结果设备名称型 号生产厂家及出厂编号有效期至编号确认编号？霉菌培养箱MJ-300BS-II上海新苗医疗器械制造有限公司(0812240005)霉菌培养箱MJ-300BS-II上海新苗医疗器械制造有限公司(1005240001)生化培养箱SPX-300BS-II上海新苗医疗器械制造有限公司（0405011）电热恒温培养箱DHP-91

22、62上海一恒科技有限公司（035184）脉动真空灭菌柜XG1.DTX-0.36B山东新华医疗器械股份有限公司（2010095520100953）脉动真空灭菌柜XG1.DTS-0.24BXG1.DTX-0.36B山东新华医疗器械股份有限公司（2012202420100953）生物安全柜BSC-1600A2苏州安泰空气技术有限公司（J10060420）生物安全柜BSC-1600A2苏州安泰空气技术有限公司（J10060421）生物安全柜BSC-1300A2苏州安泰空气技术有限公司（J10050341）电子天平PB602-N梅特勒-托利多仪器有限公司（1201130089）电子天平GF-200日本A

23、ND（14678558）评价：确认人/日期： 复核人/日期：附件4 ：试验器材确认结果试验器材确认结果名称型 号来 源检查项目及标准检查结果微孔滤膜孔径0.45m，直径50mm杭州高得泰林有限公司完整，无破损封闭式无菌检查薄膜过滤器STV2、STV3型浙江宁海白石药检仪器厂完整，洁净，无破损评价：确认人/日期： 复核人/日期：附件5 ：试验用菌种确认结果试验用菌种确认结果菌种名称及编号来 源保存方法及条件菌种代数（不得超过第五代）/形态特征金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003中国药品生物制品检定所培养基斜面2-8大肠埃希菌CMCC（B）44102中国药品生物制品检定所培养基斜面2-8枯草芽孢

24、杆菌CMCC（B）63501中国药品生物制品检定所培养基斜面2-8白色念珠菌CMCC（F）98001广州市药品检验所培养基斜面2-8黑曲霉CMCC（F）98003广州市药品检验所培养基斜面2-8评价：确认人/日期： QA复核人/日期：菌种名称及编号来 源保存方法及条件菌种代数（不得超过第五代）/形态特征金黄色葡萄球菌ATCC6538CMCC（B）26003美国菌种收集中心中国药品生物制品检定所培养基斜面2-8大肠埃希菌ATCC8739美国菌种收集中心培养基斜面2-8大肠埃希菌铜绿假单胞菌ATCC87399027CMCC（B）44102美国菌种收集中心中国药品生物制品检定所培养基斜面2-8枯草芽

25、孢杆菌ATCC6633CMCC（B）63501美国菌种收集中心中国药品生物制品检定所培养基斜面2-8白色念珠菌ATCC10231CMCC（F）98001美国菌种收集中心广州市药品检验所培养基斜面2-8黑曲霉ATCC16404CMCC（F）98003美国菌种收集中心广州市药品检验所培养基斜面2-8评价：确认人/日期： 复核人/日期：附件6：培养基确认结果培养基确认结果培养基名称来 源检查项目及标准批号/有效期至/检查结果营养琼脂培养基北京三药科技开发公司1.应在有效期内2.应做适用性检查营养琼脂培养基胰酪胨大豆琼脂培养基北京三药科技开发公司北京三药科技开发公司1.应在有效期内2.应做适用性检查1

26、.应在有效期内2.应做适用性检查胰酪胨大豆琼脂培养基北京三药科技开发公司1.应在有效期内2.应做适用性检查改良马丁琼脂培养基北京三药科技开发公司应在有效期内改良马丁琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基北京三药科技开发公司1.应在有效期内2.应做适用性检查评价：确认人/日期： 复核人/日期：附件7：试剂确认结果 试剂确认结果试剂名称规格来 源检查项目及标准批号/有效期至pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液250g/瓶北京三药科技开发公司应在有效期内氯化钠500g/瓶广州化学试剂厂应在有效期内新洁尔灭溶液500ml/瓶广东恒健制药有限公司应在有效期内洗必泰5kg/箱锦州九泰制药有限责任公司应在有效期内吐温80

27、500ml/瓶天津市大茂化学试剂厂应在有效期内评价：确认人/日期： 复核人/日期：附件8：器皿确认结果 器皿确认结果容器名称规格型号检查项目及标准检查结果培养皿9cm洁净，无破损烧杯1000ml、500ml洁净，无破损蓝盖瓶500ml、250ml、100ml洁净，无破损试管18mm×180mm、30 mm×200mm洁净，无破损刻度吸管10 ml 、5 ml、2 ml、1ml洁净，无破损量筒500ml、100ml洁净，无破损应校准评价：确认人/日期： 复核人/日期：附件9：总菌落数计数验证结果记录 总菌落数计数验证结果记录检品名称： 批号： 验证日期： 检验方法：试验菌种菌

28、种编号菌液组（验证加菌数）试验组（检品+验证加菌数）稀释剂对照组（稀释剂+验证加菌数）供试品对照组（检品本底菌数）试验组菌回收率%稀释剂对照组菌回收率%皿1皿2平均皿1皿2平均皿1皿2平均皿1皿2平均金黄色葡萄球菌大肠埃希菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉备注：试验组的回收率（%）=（试验组平均菌落数供试品对照组平均菌落数）÷菌液组的平均菌落数×100%稀释剂对照组的回收率（%）=稀释剂对照组的平均菌落数÷菌液组的平均菌落数×100%回收率应不低于70%结果评定：检验人/日期： 复核人/日期： 附件10：检验记录检验记录品 名：免洗注射用冷冻干燥无菌粉末用氯化丁基橡胶塞抗生素瓶用铝塑组合盖 批 号：批 号：来 源： 实验环境： 、RH %来 源：检验标准：中国药典欧洲药典中国药典2010年版二部附录2010年版二部 微生物限度检验法 检验日期： 年 月 日1.仪器细菌培养箱型号（编号）： ；校准有效期至：