细胞冻存与计数

1、第五章第五章 细胞冻存与细胞计数细胞冻存与细胞计数n一、非玻璃化冻存一、非玻璃化冻存冻存方法举例（肿瘤细胞）冻存方法举例（肿瘤细胞）n1.1.主要材料主要材料n(1)(1)仪器设备：普通冰箱、仪器设备：普通冰箱、-20-20低温冰箱和低温冰箱和- -7070-80-80超低温冰箱、液氮冻存罐、离心机超低温冰箱、液氮冻存罐、离心机等。等。n(2)(2)冻存管：容量为冻存管：容量为1ml1ml或或1.5ml1.5ml。n(3)(3)冷冻保护液：冷冻保护液：FBS:DMSO:培养基培养基-4：1：5n现配现用，或配制后放入普通冰箱冰盒内冷现配现用，或配制后放入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前，于室温下

2、水浴融解。冻保存。使用前，于室温下水浴融解。n(4)(4)待冻存细胞：肿瘤细胞待冻存细胞：肿瘤细胞 n2.2.冻存过程冻存过程 n(1)(1)待冻存细胞悬液的准备待冻存细胞悬液的准备 n按常规方法消化处于按常规方法消化处于对数生长期对数生长期的细胞培养物。的细胞培养物。n将细胞悬液以将细胞悬液以8008001000r1000rminmin离心离心5min5min，弃上，弃上清液。清液。n向沉淀物中加入培养基向沉淀物中加入培养基, ,轻轻吹吸均匀，制备成轻轻吹吸均匀，制备成单细胞悬液，计算细胞总数单细胞悬液，计算细胞总数。n将细胞悬液与冻存液按将细胞悬液与冻存液按1 1：1 1混合，使细胞密度混

3、合，使细胞密度达达1 110106 61 110107 7个个/ml/ml。n按每管按每管1ml1ml的量，的量，分装分装于冻存小管内。拧紧管盖。于冻存小管内。拧紧管盖。n在冻存小管上做在冻存小管上做标记标记，包括细胞代号及冻存日，包括细胞代号及冻存日期。期。n(2)(2)分级冷冻：分级冷冻：（有几种方法可以使用）有几种方法可以使用）n先将冻存小管放人普通冰箱冷藏层先将冻存小管放人普通冰箱冷藏层(4(4 8)8)，约，约40min40min。n接着置于普通冰箱冷冻层接着置于普通冰箱冷冻层(-10(-10- - 20) 20)，303060min60min。n再于再于-30-30放置放置30mi

4、n30min左右（可省略）。左右（可省略）。n然后在然后在-70-70-80-80下过夜。下过夜。n最后将冻存小管投入液氮保存。最后将冻存小管投入液氮保存。n还有一种简单的方法，就是将冻存小管先悬挂在还有一种简单的方法，就是将冻存小管先悬挂在液氮罐口液氮罐口20 min20 min，再直接投入液氮中保存。，再直接投入液氮中保存。n第三种方法是，用第三种方法是，用44预冷的冷冻保护液悬浮细胞，预冷的冷冻保护液悬浮细胞，分装冻存小管后，将冻存小管放在分装冻存小管后，将冻存小管放在44下下30min30min；然后置于壁厚然后置于壁厚1 cm1 cm以上的泡沫塑料小盒内封好，以上的泡沫塑料小盒内封好

5、，立刻将小盒放置在立刻将小盒放置在-70-70-80-80冰箱中冰箱中24h24h以上至以上至1 1周周；再将冻存小管投入液氮中保存。；再将冻存小管投入液氮中保存。n(3)(3)记录：记录：做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及冻存经手人。冻存位置以及冻存经手人。n3.3.冻存结果冻存结果如此冻存的细胞，其存活率可达如此冻存的细胞，其存活率可达90%90%以上。以上。盒夹层内装入100%异丙醇。程序降温盒放到-80度的冰箱里，盒内温度就会成线性下降，可实现每分钟1的

6、降温，可大大的提高细胞的存活率。程序降温盒程序降温盒注意事项：注意事项：n在使用在使用DMSODMSO前，不需要对其进行高压灭菌，因其前，不需要对其进行高压灭菌，因其 本身就有灭菌作用。本身就有灭菌作用。 n在常温下，在常温下，DMSODMSO对人体有毒，故在配制冷冻保护对人体有毒，故在配制冷冻保护 剂时最好带手套。剂时最好带手套。n冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以避免冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以避免 液氮从液氮罐内溅出。液氮从液氮罐内溅出。 n应注意控制冻存细胞的质量。应注意控制冻存细胞的质量。n勿将冻存的细胞放置在勿将冻存的细胞放置在0 0-60-60这一温度范围内这一温度

7、范围内 过长时间，低温损伤主要发生在这一温度范围内。过长时间，低温损伤主要发生在这一温度范围内。 二、细胞计数二、细胞计数n用用细胞计数法细胞计数法测定细胞生长动力学是测定细胞生长动力学是 目前采用的最普遍的方法。目前采用的最普遍的方法。血细胞计数板人工计数血细胞计数板人工计数 细胞计数器细胞计数器 血细胞计数板：常用的是改良的纽巴氏血细胞计数板：常用的是改良的纽巴氏(Neubauer)(Neubauer)血细胞计数板。血细胞计数板。 n具体操作程序如下：具体操作程序如下：n1 1、取血细胞计数板和盖玻片，用取血细胞计数板和盖玻片，用75%75%酒精酒精擦净。将盖玻片放于计数板上。擦净。将盖玻

8、片放于计数板上。n2 2、用滴管取用滴管取混合均匀混合均匀的细胞悬液，滴入计的细胞悬液，滴入计数室内。要保证盖片下充满悬液，注意盖数室内。要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。滴加细胞悬液后约槽中。滴加细胞悬液后约静置静置1 1分钟后分钟后则可则可以进行计数。以进行计数。n3 3、统计四个大格的细胞数统计四个大格的细胞数：将血球计数板将血球计数板放于显微镜的放于显微镜的低低倍镜下观察，并移动计数倍镜下观察，并移动计数板，分别数出四角的四个大格（每个大格板，分别数出四角的四个大格（每个大格含有含有1616个中格）中的细胞数。个中

9、格）中的细胞数。n对压边线细胞：对压边线细胞：计上不计下，计左不计右计上不计下，计左不计右 计算：一般以计算：一般以每毫升含细胞数每毫升含细胞数来表示来表示 n大方格的面积为大方格的面积为1mm1mm2 2，室深为，室深为0.1mm0.1mm，则体积，则体积为为0.1mm0.1mm3 3。推算得。推算得0.1mm0.1mm3 310104 4，才为，才为1ml1ml体积。体积。所以计算公式为：所以计算公式为：n细胞悬液的细胞数细胞悬液的细胞数/ml/ml（ 四个大格子细胞数四个大格子细胞数/4)/4) 10104 4 稀释倍数稀释倍数计数中，如果细胞悬液的细胞浓度过高，必须稀计数中，如果细胞悬

10、液的细胞浓度过高，必须稀释后再计；如果细胞数太少释后再计；如果细胞数太少, ,可离心浓缩后再计。可离心浓缩后再计。每个细胞悬液至少滴样两次求平均值。每个细胞悬液至少滴样两次求平均值。 n用细胞计数板计数时应注意的事项用细胞计数板计数时应注意的事项: :1 1不要漏计，不要重复不要漏计，不要重复 2 2细胞悬液应混合均匀细胞悬液应混合均匀 3 3浓度不可过高也不可过低。浓度不可过高也不可过低。四、活细胞的染料排除检测法四、活细胞的染料排除检测法n原理：原理：由于由于死细胞死细胞的的细胞膜通透性细胞膜通透性发生改发生改变，某些染料可大量进入却不被排出，因变，某些染料可大量进入却不被排出，因而细胞而

11、细胞呈色呈色。而。而活细胞活细胞反之，能排出进入反之，能排出进入细胞内的染料，因而细胞内的染料，因而不易着色不易着色。此法的原。此法的原理即是理即是利用死、活细胞对染料的不同反应利用死、活细胞对染料的不同反应而区分开两种细胞。而区分开两种细胞。n最常用的为最常用的为“台盼蓝台盼蓝排除检测法排除检测法”n(1)0.4(1)0.4台盼蓝溶液的配制：台盼蓝溶液的配制： 称取称取4g4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至蒸水至100ml100ml，用滤纸过滤，用滤纸过滤，4 40 0C C保存。使保存。使用时。用用时。用PBSPBS稀释至稀释至0.4%0.4%。即成工作液。即成工作液。n(2)(2)活体染色与细胞计数活体染色与细胞计数n将将1 1滴细胞悬液滴细胞悬液( (贴壁细胞可经贴壁细胞可经0.250.25胰胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成细胞悬液蛋白酶溶液消化后，吹打制成细胞悬液) )与与2 2滴台盼蓝液滴台盼蓝液混合后，混合后，滴入细胞计数板滴入细胞计数板。n