westernblot详解实用教案

1、垂直电泳(din yn)、电转装置 电泳槽 玻璃板、梳子、加样校准架等 电转移槽 切胶板、黑白(hibi)夹板、海绵垫等 电泳仪 用途：用于生物学实验中对特定目的蛋白质的分离，定性及定量的检测分析(fnx)，是Western-blot（蛋白免疫印迹）实验中非常重要的部分。 第1页/共53页第一页，共54页。 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对

2、应的抗体（一抗）起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二(d r)抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。Western blot 实验(shyn)原理抗原一抗生物素标记的二抗ECL发光试剂第2页/共53页第二页，共54页。Western blot Western blot 检测蛋白表达实验检测蛋白表达实验(shyn)(shyn)流程流程第3页/共53页第三页，共54页。SDS-PAGE电泳(din yn)的基本原理 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶是在PAGE凝胶中引进SDS（十二烷基磺酸钠，

3、含有大量带负电荷的SO32-），SDS能破坏蛋白质分子的二级、三级结构，在含有强还原剂的溶液中可与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物。由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了，从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异(chy)的作用，蛋白质在SDS-PAGE胶中的迁移率主要取决于其分子量的大小。第4页/共53页第四页，共54页。PAGEPAGE：聚丙烯酰胺凝胶：聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)N,N-亚甲基双丙烯酰胺(N,

4、N-methylenebisacylamide，简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性(duxng)强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。第5页/共53页第五页，共54页。聚丙烯酰胺凝胶的聚合聚丙烯酰胺凝胶的聚合(jh)方方式：式： 单体：丙烯酰胺（Acr）； 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）； 催化剂：过硫酸(li sun)胺或核黄素（AP）； 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）； 产物：三维网状结构凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供(tgng)氧游离基(free radicals)的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redo

5、x systems)来完成的。催化体系主要有化学催化（APTEMED）和光化学催化（核黄素TMTED）体系。第6页/共53页第六页，共54页。第7页/共53页第七页，共54页。一 配分离胶准备物品： 玻璃板 洗衣粉 灌胶架 移液枪 两个烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） 30%Acrylamide 1M （4度冰箱(bngxing)）， Tris-HCL 溶液（PH=8.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱(bngxing)） ， TEMD（4度） ，SDS（常温）1 清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用ddH2O冲洗干净后立在

6、通风处或烘箱中2 配制分离胶：玻璃板对齐后放入夹中加紧，注意使两玻璃板对齐。然后垂直卡在架子上准备灌胶。先配制分离胶。配方如下：第8页/共53页第八页，共54页。 具体情况依照(yzho)说明书第9页/共53页第九页，共54页。 灌分离胶：用1ml的移液枪吸取1ml胶沿玻璃放出，溶液缓慢(hunmn)加入到装配好的玻璃板中至凝胶高度为6cm左右，预留1.5cm高度配制浓缩胶。用1ml的移液枪吸取1ml左右的异丙醇，压平。沿玻璃放出，注意速度要慢，否则胶会被冲变形。温箱放置0.5-1h左右至聚合完全。注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速灌胶， 灌胶速度须缓慢(hunmn)，避免产生气泡 灌胶之

7、上轻轻加一层异丙醇，用来压平第10页/共53页第十页，共54页。灌制灌制(un zh)分离胶分离胶 隔绝空气隔绝空气ddH2O0.1%SDS:8%第11页/共53页第十一页，共54页。二 配制浓缩胶准备物品： 移液枪 烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） Tips：30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（PH=6.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度） ，SDS（常温(chngwn)）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已经凝了。 倾倒掉胶上层的异丙醇，后用吸水纸吸干。 注意吸水纸不要触碰分离胶10%的分离胶配合6%的浓缩胶使用

8、。配制浓缩胶，配方如下：第12页/共53页第十二页，共54页。6%的浓缩胶4mlddH2O2.39ml30%Acrylamide0.544ml1 M T r i s - H C L 溶 液（PH=6.8）1.02ml10%APS40.82ulTEMD2.04ul第13页/共53页第十三页，共54页。配胶方法同上，各种溶液加入到烧杯中，后震荡。灌浓缩胶：用1ml的移液枪将玻璃板中的剩余空间灌满浓缩胶，灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。将剩余空间灌满浓缩胶然后(rnhu)将梳子插入浓缩胶中。 灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。冰箱过夜待浓缩胶凝固(

9、nngg)后，取保险膜铺平于桌上，另取两张草纸铺于保鲜膜上。用ddH2O浸湿草纸。取玻璃板放于草纸上，包好。放入4冰箱过夜。第14页/共53页第十四页，共54页。浓缩胶的浓度(nngd)比较低（5%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺），里面的孔径也比较大，所有的蛋白都能够在进入分离胶之前在同一水平线上（因为在你加样的时候蛋白是分布在加样孔中的，不在同一水平线上。） 分离胶的胶浓度(nngd)比较大（10%），里面胶孔径也比较小，这样施加电压的时候小的蛋白可以穿过孔跑到下面去，而分子量大的蛋白就可能被拦住，就跑的慢。通过这种方式以分子量大小的区别来分离蛋白质第15页/共53页第十五页，共54页。插梳子插梳

10、子(sh zi)(sh zi)第16页/共53页第十六页，共54页。第17页/共53页第十七页，共54页。三 电泳(din yn)： 固定：将玻璃板等装置固定在电泳槽内 上样：上所需要(xyo)的蛋白质样品 电泳第18页/共53页第十八页，共54页。31 固定(gdng)用ddH2O水冲洗一下玻璃板，将其放入电泳槽中。注意，小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。向电泳槽中加入1x电泳液拔掉梳子(sh zi)，注意动作轻柔。 5X电泳(din yn)液缓冲液 Tris（MW121.14） 15.1g 甘氨酸（MW75.07） 94g SDS 5.00g 蒸馏水至 1000ml 第19页/共53页第十九

11、页，共54页。32 上样 蛋白质样品的提取与制备蛋白浓度(nngd)的测定计算上样量用微量注射器吸取蛋白加入到上样孔中。一般蛋白MARK的上样孔在两边。第20页/共53页第二十页，共54页。311 蛋白样品制备(zhbi) （1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、 倒掉培养液，将瓶倒扣在吸水纸使其吸干培养液。 2、 向培养皿中加入裂解液，通常6孔板150-200ul/孔， 12孔板50-60ul/孔，冰上放置，摇床20min 3、 用勺子刮下细胞，并吸出液体至1.5ml离心管中，勺 子在处理不同样本前清水洗净、擦干（注意冰上操作） 4、 于4下12000rpm离心5min。 5、 将离心后的上

12、清分装转移倒1.5min的离心管中放于-80保存。 第21页/共53页第二十一页，共54页。 （2 2） 组织中总蛋白的提取：组织中总蛋白的提取： 1.1.将将200mg200mg组织块剪碎，置于组织块剪碎，置于1ml1ml裂裂解液中（解液中（5ml5ml离心管）。离心管）。 2.2.匀浆匀浆(yn jin)(yn jin)器进行匀浆器进行匀浆(yn (yn jin)jin)，注意冰上操作，匀浆，注意冰上操作，匀浆(yn (yn jin)jin)后置于冰上。后置于冰上。 3.103.10，000g ,4,10min,000g ,4,10min,（5ml5ml管）管）离心离心 4.4.取上清至取

13、上清至1.5ml1.5ml管，管，1212，000g 000g ,4,60min, ,4,60min, 离心离心 5. 5.取取上清至新上清至新1.5ml1.5ml管管,-80,-80储存储存 第22页/共53页第二十二页，共54页。312 蛋白蛋白(dnbi)样品浓度的测定方法样品浓度的测定方法定氮法双缩脲法Folin-酚试剂(shj)法紫外吸收法考马斯亮蓝法BCA法第23页/共53页第二十三页，共54页。1.Bradford法简介(jin ji)原理：考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定(ydng)浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化

14、合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。制作标准曲线 （插入表格）检测样品蛋白含量：取一管考马斯亮蓝+95 l 0.15mol/L NaCl NaCl溶液+5l待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入比色杯中测试。第24页/共53页第二十四页，共54页。第25页/共53页第二十五页，共54页。2.BCA法简介实验试剂: BCA试剂，标准蛋白质溶液试验方法: 根据吸光值可以(ky)推算出蛋白浓度。实验操作: 绘制标准曲线原理：BCA(bicinchonininc acid二辛可宁酸)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在

15、碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。第26页/共53页第二十六页，共54页。313313蛋白蛋白(dnbi)(dnbi)上样量的计算上样量的计算 取含有提取好的蛋白的EP管，放在冰上融化，计算(j sun)上样量。可计算(j sun)含50-100ug蛋白的溶液体积即为上样量（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）取出样品至EP管中，加入1上样缓冲液至相同的上样体积（上样总体积一般不超过30l）。上样前要将样品于沸水中煮5-10min使蛋白变性。4X上样缓冲液

16、1.0 mol/L TrisHCl（pH6.8） 2ml SDS 0.8g 溴酚蓝 0.04g 甘油 4ml去离子水定容至10ml。混匀后，分装于1.5ml离心管中，4保存(bocn)。使用时稀释成1X。第27页/共53页第二十七页，共54页。314 上样上样 (注意：最外两泳道易跑歪，尽量不用。) Marker 6l （Marker加在最边上的加样孔中） 样本 20-30l 实验所用Marker电泳后出现10条带：10，15，25，35，40，55，70，100，130，170KDa 根据分子量的大小确定电压和时间，marker 跑开后变压，一般溴酚蓝离胶下 cm停止电泳进行转膜（一般要让目

17、的(md)条带跑过分离胶的1/3比较好）第28页/共53页第二十八页，共54页。主要目的是确定靶蛋白的分子量大小；使用预染的Marker还可以实时(sh sh)检测电泳分离情况，并可以转移到膜上。蛋白质蛋白质MarkerPrestained protein laddersUnstained protein laddersFermentas第29页/共53页第二十九页，共54页。上样缓冲液 Loading buffer 显示电泳进程(jnchng) 其中甘油可以增大样品密度，使样品沉降到点样孔上，防止样品漂出第30页/共53页第三十页，共54页。上样第31页/共53页第三十一页，共54页。Ano

18、de -内槽缓冲液带有负电荷，与凝胶顶部(dn b)接触外槽中缓冲液带有正电荷，与凝胶底部接触(jich)Cathode +带有负电荷的蛋白质从上到下运动（负极到正极(zhngj)），分开电泳进程可以根据前沿指示剂来确定，等其跑到底部上面1cm左右即可停止电泳小分子量蛋白跑的比较快. . 蛋白根据分子量大小分开蛋白质带有负电荷，因此电泳时可以从负极向正极移动标本加入到上样孔中第32页/共53页第三十二页，共54页。第33页/共53页第三十三页，共54页。四 转膜 准备(zhnbi)物品：转移槽 黑红夹子 NC膜 滤纸 海绵垫 转膜缓冲液 （1） 转一张膜需准备(zhnbi)6张滤纸和1张NC膜

19、。 切滤纸和膜时一定要戴手套。将切好的NC膜和滤纸置于1X转模缓冲液浸湿。 10X转膜缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g 蒸馏水至 1000ml 溶解(rngji)后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至20% 第34页/共53页第三十四页，共54页。（2）夹子黑的一面：海绵-3张滤纸-胶-NC膜-3张滤纸-海绵将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫。在垫子上垫三层滤纸，固定滤纸,擀去其中的气泡。 刮去玻璃板上的浓缩胶，小心剥下下层胶，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将NC膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张

20、滤纸并除去气泡。膜盖下后不可再移动。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在1X转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互(xingh)接触，接触后会发生短路。第35页/共53页第三十五页，共54页。将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用100V转移1.5h。实际上应该根据蛋白(dnbi)分子量的大小确定转膜时间不同的转膜装置，转移效率是不一样的，所以换用转膜装置，最好再摸个条件； 转膜时电极方向注意是膜正胶负。第36页/共53页第三十六页，共54页。五 封闭(fngb)准备物品(wpn)： 封闭液

21、BSA（5%脱脂牛奶) 摇床 1x洗膜液 1 转完膜后，关闭电源。取出转膜槽，拿出夹子，取膜。2 取已经配制好的封闭液（5%脱脂牛奶) ，加入到容器中。用镊子将膜的一角夹起，放入到封闭液（5%脱脂牛奶) ，注意使转有蛋白的一面朝上。放置在摇床上封闭2-3h或过夜。根据蛋白Marker的标记，切出目的蛋白的条带和内参蛋白的条带。第37页/共53页第三十七页，共54页。 1XTBST1XTBST缓冲液缓冲液 10XTBS 10XTBS缓冲液缓冲液 100ml 100ml 蒸馏水蒸馏水 900ml 900ml Tween-20 1 ml Tween-20 1 ml 因因Tween-20Tween-2

22、0比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡即可防止产生气泡(qpo)(qpo)。溶解后室温保存。溶解后室温保存。封闭液BSA（5%脱脂牛奶)： 1XTBST缓冲液 95-100 ml 脱脂奶粉 /BSA 5g溶解(rngji)后4保存，可于一周内使用。第38页/共53页第三十八页，共54页。六六 抗体抗体(kngt)(kngt)的孵育的孵育一抗的孵育准备物品： 目的蛋白一抗 内参蛋白（GAPDH，beta-actin或beta-tubulin）一抗 摇床 将一抗用封闭液稀释(xsh)至适当浓度（目的蛋白GluT3 1:300, actin

23、 1:2000）；将膜蛋白面朝上放于槽中，加入抗体放在摇床上室温下孵育1-2h或过夜（目的蛋白GluT3 1.5h,actin 1h）洗膜 TBST洗膜放在摇床上震荡10min，弃去洗膜液，如此反复3次。 。第39页/共53页第三十九页，共54页。二抗的孵育二抗的孵育(f y)(f y) 根据说明书推荐浓度使用TBST稀释二抗。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳(zu ji)稀释度（1:1000-1:20000）。孵育条件一般为室温1-2小时或过夜 洗膜 TBST洗膜放在摇床上震荡10min，弃去洗膜液，如此反复3次。准备物品： 目的蛋白二抗 内参(ni cn)蛋白（GAP

24、DH，beta-actin或beta-tubulin）二抗 容器 4冰箱 摇床 从-20冰箱中取出已经稀释好的二抗溶液，室温下融化。第40页/共53页第四十页，共54页。七七 ECL ECL化学发光检测化学发光检测(jin c)(jin c)（显影）（显影） 准备物品及仪器： Imagequant仪器 显影液（A+B）移液枪 Tips 玻璃板 EP管 浅盘1 洗膜后，将膜放于草纸上，将洗膜液吸净2 进入曝光室后，关闭电源，注意避光。3 根据膜的大小来估计加入显影液的量。将等量A液和B液加入到EP管中混匀后，用移液枪吸取均匀点于膜上。4 放入机器中，点击fouces按钮，观察膜的位置是否放正。5

25、 点击Start按钮，选择auto进行曝光。然后进行图片保存(bocn)，注意，有两种图片保存(bocn)格式。7根据曝光后条带显影的强弱选择手动曝光的时间。第41页/共53页第四十一页，共54页。手动曝光手动曝光(bo gung)(bo gung)将A和B两种试剂等量（常用各500l）在5ml离心管中等体积混合； 打开X-光片夹，铺上保鲜膜，将NC膜面朝上放于保鲜膜上，滴加此混合液1-3min后（见到荧光）将显影液和定影液分别到入盘中；在红灯下，取出X光片，把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间(shjin)，一般为1min到5min，也可选择不同时间(shjin)多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，将X-光片迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影结束后，再放到定影液中进行定影。定影时间(shjin)一般为510min，以胶片透明为止第42页/共53页第四十二页，共54页。第43页/共53页第四十三页，共54页。第44页/共53页第四十四页，共54页。常见问题第45页/共53页第四十五页，共54页。第46页/共53页第四十六页，共54页。第47页/共53页