Westernblot技术详细实用教案

1、定义定义(dngy)： 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用(lyng)相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用(lyng)DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法第1页/共27页第一页，共28页。Western Blot基本原理基本原理 在电场的

2、作用下将电泳分离的多肽(du ti)从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽(du ti)的特异抗体来检测。快速、特异，信号快速、特异，信号(xnho)弱、弱、昂贵昂贵信号强、二抗选择信号强、二抗选择(xunz)多，非多，非特异性结合特异性结合第2页/共27页第二页，共28页。 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳l转膜l封闭(fngb)l一抗杂交l二抗杂交l底物显色n蛋白(dnbi)样品的制备第3页/共27页第三页，共28页。第4页/共27页第四页，共28页。裂解裂解(li ji)液液第5页/共27页第五页，共28页。SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：原理： SDS 是一种离子性

3、的界面活性剂是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水子也带有疏水性的长碳链性的长碳链.当当 SDS 与蛋白质混合时与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子而以硫酸根离子外露与水分子(fnz)作用作用.大多数蛋大多数蛋白质和白质和 SDS 的平均结合量是的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位以重量为单位),而蛋白而蛋白质结合固定质结合固定比例之比例之 SDS 後後,由於由於 SDS 带强负价带强负价,使蛋白质原先的带电价使蛋白质原先的带电价微不

4、足道微不足道,且且每单位重量之蛋白质带电价一致每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子(fnz)大小一项因素大小一项因素第6页/共27页第六页，共28页。M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 MSDSM配胶的Tris缓冲液MTEMEDM过硫酸铵(时间(shjin)MTris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶成份凝胶成份(chng fn)第7页/共27页第七页，共28页。第8页/共27页第八页，共28页。第9页/共27页第九页，共28页。第10页/共27页第十页，共28页。第11页/共27页第十一页，共28页。

5、大于大于20KD0.45 um20KD0.2 um7KD0.1 um第12页/共27页第十二页，共28页。转膜半干法半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间。（小分子量蛋白润滤纸之间。（小分子量蛋白(dnbi)(dnbi)）湿法湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中。（大分子量蛋白置的缓冲液中。（大分子量蛋白(dnbi)(dnbi)） 第13页/共27页第十三页，共28页。湿转第14页/共27页第十四页，共28页。半干转第15页/共27页第十五页，共28页。第16页/共27

6、页第十六页，共28页。一抗、二抗孵育(f y) 把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37一小时，4 过夜。 倒掉一抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢(hunmn)摇动， 37一小时，4 过夜。 倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次10min。第17页/共27页第十七页，共28页。辣根过氧化物(u yn hu w)酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）化学发光显色法(HRP)DAB 显色法：方便、经济，反应慢、不易保存、不能重新剥离显色法：方便、经济，反应慢、不易保存、

7、不能重新剥离(bl)检测检测ECL发光法：灵敏、快速、反应快、能重新剥离发光法：灵敏、快速、反应快、能重新剥离(bl)检测检测第18页/共27页第十八页，共28页。第19页/共27页第十九页，共28页。第20页/共27页第二十页，共28页。第21页/共27页第二十一页，共28页。第22页/共27页第二十二页，共28页。背景(bijng)太高1.1.膜没有均匀浸湿膜没有均匀浸湿2.2.膜或者缓冲液污染膜或者缓冲液污染3.3.封闭不充分封闭不充分4.4.抗体与封闭剂出现交抗体与封闭剂出现交叉反应叉反应5.5.抗体浓度过高抗体浓度过高 原因对策1.1.转膜前用转膜前用100%100%甲醇将膜完甲醇将

8、膜完全浸湿全浸湿2.2.拿取膜与吸水纸时要戴手拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液套，更换新鲜转膜缓冲液3.3.检测一抗、二抗与封闭剂检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应是否有交叉反应4.4.杂交前检测一抗、二抗的杂交前检测一抗、二抗的工作浓度工作浓度第23页/共27页第二十三页，共28页。没有阳性(yngxng)条带或比较弱1.1.抗体染色不充分抗体染色不充分2.2.靶蛋白含量太低靶蛋白含量太低3.3.HRPHRP抑制剂抑制剂4.4.转膜时间不够转膜时间不够5.5.曝光时间过短曝光时间过短 原因对策1.1.增加抗体滴度，延长孵育增加抗体滴度，延长孵育时间时间2.2.增加样本上样量增加

9、样本上样量3.3.所用溶液和容器中避免含所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠有叠氮化钠4.4.大分量蛋白相应增加转膜大分量蛋白相应增加转膜时间及曝光时间时间及曝光时间第24页/共27页第二十四页，共28页。弥散(msn)性条带或非特异性条带1.1.抗体浓度太高抗体浓度太高2.2.蛋白上样量太多蛋白上样量太多3.3.交叉交叉(jioch)(jioch)反应反应 原因原因(yunyn)对策1.1.降低抗体浓度降低抗体浓度2.2.降低样本上样量降低样本上样量第25页/共27页第二十五页，共28页。第26页/共27页第二十六页，共28页。谢谢您的观看(gunkn)！第27页/共27页第二十七页，共28页。NoImage内容(nirng)总结定义：。快速、特异，信号弱、昂贵。对于难溶解蛋白，应选(yn xun)用裂解强度更高的裂解液（如RIPA, SDS)。把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养