基因工程制药PPT学习教案

1、会计学1基因工程制药基因工程制药第1页/共71页第2页/共71页第一节第一节 基因工程药物概述基因工程药物概述第二节第二节 基因工程药物的表达基因工程药物的表达第三节第三节 基因工程药物的生产基因工程药物的生产第四节第四节 基因药物实例基因药物实例转基因动植物制药转基因动植物制药第3页/共71页发现和确证药物靶标发现和确证药物靶标设计新分子设计新分子产生生物分子库产生生物分子库新的生物分子新的生物分子下游工程下游工程生物药物制剂生物药物制剂新的生物药物新的生物药物生物信息学生物信息学基因组学基因组学功能基因组学功能基因组学蛋白质组学蛋白质组学蛋白质工程蛋白质工程分子结构和活性的关系分子结构和活

2、性的关系蛋白质化学蛋白质化学NMR，质谱质谱X光晶体衍射光晶体衍射代谢工程代谢工程糖基化工程糖基化工程天然配基天然配基第4页/共71页第一节第一节 基因工程药物概述基因工程药物概述意义：自意义：自2020世界世界7070年代基因工程诞生以来，最先应用基因工程技术且目前最为活跃的研究领域便是医药科学。基因工程技术的迅猛发展使人们已能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获得的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。年代基因工程诞生以来，最先应用基因工程技术且目前最为活跃的研究领域便是医药科学。基因工程技术的迅猛发展使人们已能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获得的生物活性物质，甚至

3、可以创造出自然界中不存在的全新物质。19821982年第一个基因重组产品年第一个基因重组产品人胰岛素在美国问世，吸引和激励了大批科学家利用基因工程技术研制新药品，人胰岛素在美国问世，吸引和激励了大批科学家利用基因工程技术研制新药品，迄今累计已有近迄今累计已有近3030种基因工程药物投入市场，产生了巨大的社会效益和经济效益。种基因工程药物投入市场，产生了巨大的社会效益和经济效益。第5页/共71页一、基因工程技术可生产的药物和制剂一、基因工程技术可生产的药物和制剂第6页/共71页第7页/共71页第8页/共71页第9页/共71页我国已批准上市的基因工程药物和疫苗我国已批准上市的基因工程药物和疫苗产品

4、名称产品名称适应症适应症开发及生产单位开发及生产单位批准时间批准时间重组人干扰素重组人干扰素1b（外用）外用）病毒性角膜炎病毒性角膜炎长春生物制品研究所长春生物制品研究所1989年试生产年试生产重组人干扰素重组人干扰素1bHBV、HCV上海生物制品研究所等上海生物制品研究所等1996年年重组人干扰素重组人干扰素2a尖锐湿疣，疱疹尖锐湿疣，疱疹等，等， HBV、HCV新大洲药业等新大洲药业等1997年年重组人干扰素重组人干扰素2bHBV、HCV安徽安科生物工程股份安徽安科生物工程股份有限公司等有限公司等1997年试生产年试生产重组人干扰素重组人干扰素类风湿类风湿丽珠医药（集团）有限丽珠医药（集团

5、）有限公司生物工程公司等公司生物工程公司等1995年试生产年试生产重组人白介素重组人白介素2癌症辅助疗法癌症辅助疗法长春生物制品研究所等长春生物制品研究所等1997年试生产年试生产重组人巨噬细胞粒重组人巨噬细胞粒细胞集落刺激因子细胞集落刺激因子（GM-CSF）化疗生白细胞化疗生白细胞厦门特宝等厦门特宝等1997年试生产年试生产重组人粒细胞集落重组人粒细胞集落刺激因子刺激因子化疗生白细胞化疗生白细胞杭州九源基因公司等杭州九源基因公司等1996年试生产年试生产第10页/共71页我国已批准上市的基因工程药物和疫苗我国已批准上市的基因工程药物和疫苗产品名称产品名称适应症适应症开发及生产单位开发及生产单

6、位批准时间批准时间重组尿激酶重组尿激酶心肌梗死溶栓心肌梗死溶栓医大实业（上海）医大实业（上海）1996年试生产年试生产重组人红细胞生成重组人红细胞生成素（素（EPO）再生障碍性贫血再生障碍性贫血南京华欣等南京华欣等1997年试生产年试生产重组人胰岛素重组人胰岛素糖尿病糖尿病通化安泰克通化安泰克1998年年重组人生长激素重组人生长激素儿童侏儒症儿童侏儒症长春金赛等长春金赛等1998年试生产年试生产重组碱性成纤维细重组碱性成纤维细胞生长因子胞生长因子创伤、烧伤创伤、烧伤珠海东大珠海东大1996年试生产年试生产乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗预防乙肝预防乙肝华北制药集团有限责任华北制药集团有限责任公司等公司

7、等重组痢疾菌苗重组痢疾菌苗预防痢疾预防痢疾军事医学科学院军事医学科学院1998年获新药证年获新药证书书重组表皮生长因子重组表皮生长因子创伤外用创伤外用中国医学科学院基础医中国医学科学院基础医学研究所学研究所2000年获新药证年获新药证书书第11页/共71页第12页/共71页基因工程药物制造的一般流程：基因工程药物制造的一般流程：（1 1）获得目的基因；）获得目的基因；（2 2）组建重组质粒；）组建重组质粒；（3 3）构建基因工程菌；）构建基因工程菌；（4 4）培养工程菌；）培养工程菌；（5 5）产物分离纯化；）产物分离纯化；（6 6）除菌过滤；）除菌过滤；（7 7）半成品检定；）半成品检定；（

8、8 8）包装）包装上游阶段上游阶段下游阶段下游阶段第13页/共71页第14页/共71页第15页/共71页一、药物基因的分离一、药物基因的分离目前基因工程药物大都是人基因片段的蛋白产物目前基因工程药物大都是人基因片段的蛋白产物，或糖基化修饰后的蛋白产物。，或糖基化修饰后的蛋白产物。真核生物的基因一般包括了若干外显子和内含子真核生物的基因一般包括了若干外显子和内含子。由于内含子不能翻译产物，因此基因工程药物。由于内含子不能翻译产物，因此基因工程药物表达所使用的基因通常是表达所使用的基因通常是cDNA，即即mRNA的反的反转录产物。转录产物。第16页/共71页特定的特定的mRNA可以通过不同的方法获

9、得。可以通过不同的方法获得。A.A. cDNAcDNA文库文库B.B. 直接从特定的直接从特定的mRNAmRNA分离基因分离基因C.C. 从蛋白质分离编码基因从蛋白质分离编码基因D.D. 基因的化学合成基因的化学合成E.E. RT-PCRRT-PCR分离基因分离基因第17页/共71页（一）（一）cDNAcDNA文库文库方法：方法： oligo(DT)亲和层析法亲和层析法一般一般 mRNA都带有都带有3polyA，所以可以用寡聚所以可以用寡聚dT作为引物，在逆转录酶的催化下，开始作为引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。链的合成。用放射性探针法检测。用放射性探针法检测。以以cDNA第一

10、链为模板合成第二链。第一链为模板合成第二链。（1）核酸探针杂交法）核酸探针杂交法（2）免疫反应鉴定法）免疫反应鉴定法第18页/共71页第19页/共71页（二）化学合成法（二）化学合成法一、不能合成太长的基因。一、不能合成太长的基因。二、人工合成基因时，遗传密码的简并会二、人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大的困难。为选择密码子带来很大的困难。三、费用高三、费用高第20页/共71页第21页/共71页二、基因表达二、基因表达基因表达是指结构基因在生物体中的转录基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。、翻译以及所有加工过程。基因表达研究是指外源基因在某种细胞中基因

11、表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片断，的表达活动，即剪切下一个外源基因片断，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。既有原生物活性又可高产的表达产物。第22页/共71页第23页/共71页（1 1）大肠杆菌：目前采用最多的原核表达体系。）大肠杆菌：目前采用最多的原核表达体系。（2 2）枯草芽孢杆菌）枯草芽孢杆菌（3 3）链霉菌）链霉菌（1 1）酵母：酿酒酵母应用广泛。）酵母：酿酒酵母应用广泛。（2 2）丝状真菌）丝状真菌（3 3）哺乳动物细胞）哺乳动物细胞（4 4）植物细胞）植物细胞第24页/共

12、71页第25页/共71页第26页/共71页2 2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素（1 1）外源基因的拷贝数）外源基因的拷贝数（2 2）外源基因的表达效率）外源基因的表达效率（3 3）表达产物的稳定性）表达产物的稳定性（4 4）细胞的代谢负荷）细胞的代谢负荷（5 5）工程菌的培养条件）工程菌的培养条件启动子的强弱启动子的强弱核糖体结合位点核糖体结合位点SDSD序列和起始密码子序列和起始密码子ATGATG的间距的间距密码子组成密码子组成 第27页/共71页第28页/共71页1 1、载体、载体（1 1）载体的复制序列）载体的复制序列包括包括YEpYEp类、类、

13、YRpYRp类、类、YRpYRp类和类和YIpYIp类。类。 （2 2）克隆载体）克隆载体由于从大肠杆菌中制备质粒由于从大肠杆菌中制备质粒比从酵母中容易，所以酵母质粒的加工和制备大比从酵母中容易，所以酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的。部分是通过大肠杆菌进行的。（3 3）表达载体）表达载体包括普通表达载体和精确表包括普通表达载体和精确表达载体。达载体。（三）酵母中的基因表达（三）酵母中的基因表达第29页/共71页表达用的酵母宿主菌应具备：表达用的酵母宿主菌应具备：菌体生长力强。菌体生长力强。菌体内蛋白酶要较弱。菌体内蛋白酶要较弱。菌株性能稳定。菌株性能稳定。 分泌能力强。分泌能力强

14、。主要与启动子、分泌信号和终止序列有关。主要与启动子、分泌信号和终止序列有关。第30页/共71页（四）动物细胞中的基因表达（四）动物细胞中的基因表达v中国仓鼠卵巢细胞（中国仓鼠卵巢细胞（CHO）v猴肾细胞（猴肾细胞（COS）CHO细胞属成纤维细胞，该细胞缺乏二氢叶酸还细胞属成纤维细胞，该细胞缺乏二氢叶酸还原酶（原酶（DHFR），），经转染可将经转染可将DHFR重组至细胞中重组至细胞中，含有，含有DHFR表达载体的重组表达载体的重组CHO细胞，经氨甲喋细胞，经氨甲喋呤（呤（MTX）培养筛选后可选择出克隆表达异源基因培养筛选后可选择出克隆表达异源基因的重组细胞。的重组细胞。哺乳动物细胞表达外源基因

15、的主要优点哺乳动物细胞表达外源基因的主要优点能识别和剪切外源基因中的内含子能识别和剪切外源基因中的内含子并加工为成熟的并加工为成熟的mRNAmRNA。第31页/共71页主要载体主要载体vSV40衍生载体衍生载体v逆转录病毒载体逆转录病毒载体v腺病毒载体（腺病毒载体（AV）v腺相关病毒载体（腺相关病毒载体（AVV）v痘苗病毒载体（痘苗病毒载体（VV）第32页/共71页第33页/共71页质粒稳定性的分析方法：质粒稳定性的分析方法：1 1、质粒不稳定产生的原因、质粒不稳定产生的原因主要与两个因素有关：主要与两个因素有关：一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；二是这

16、两种菌的生长比速率差异的大小。二是这两种菌的生长比速率差异的大小。第34页/共71页二阶段培养法：第一阶段先使菌体生长二阶段培养法：第一阶段先使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。达。2 2、提高质粒稳定性的方法、提高质粒稳定性的方法第35页/共71页第三节第三节 基因工程药物的生产基因工程药物的生产第36页/共71页第37页/共71页基因工程药物是转基因产品，具有潜在的危险，基因工程药物是转基因产品，具有潜在的危险，因此对产生菌的管理要求严格，应该避免各种可因此对产生菌的管理要求严格，应该避免各种可能的扩散污染，必须在合格的能的扩散污染，必须在合格的GMP生产车间进行生产车间进行。基因工程药物的基因工程药物的GMP是对生产全过程的质量管理是对生产全过程的质量管理，涉及人员、厂房、设备，原材料采购入库、检，涉及人员、厂房、设备，原材料采购入库、检验、发料、加工、制品及半成品检验、分包装，验、发料、加工、制品及半成品检验、分包装，成品检定，产品销售、运输，用户意见及使用反成品检定，产品销售、运输，用户意见及使用反应处理等在内的全过程的质量管理。应处理等在内的全过程的质量管理。第38页/共71页第39页/共71页第40页/共71页第41页/