猪超低温冷冻保存技术研究

1、猪精液冷冻保存技术研究进展摘要：随着人工授精技术（AI）在实际生产中的广泛应用，猪精液冷冻保存技术也逐渐发展起来. 此项技术解决了精液长期保存的问题，使精液的应用不受时间和空间的限制，便于开展跨区域、跨国家的种质资源的交流协作，延长了优良种公猪的利用年限，从而大大提高了其利用率，对品种的改良、血统的更新以及育种成本的降低等方面意义重大.本文主要对猪精液冷冻的研究简史进行描述，并总结了目前猪精液冷冻过程中冷冻保护剂的添加以及冷冻解冻后的精液品质的检测，从而对今后的实验设计与操作，生产技术等起到一定的指导作用。关键词：猪精液，冷冻保存，冷冻保护剂，精液质量检测精液冷冻保存技术的原理是利用液氮（1%

2、)、干冰79)或其它冷源，将精液经过适当的处理，使精子细胞的代谢完全停止，在升温后可恢复原来部分活性，从而达到长期保存的目的。使用时再解冻进行人工授精(Atiificial insemination，Al)或体外授精(In vitro fertillzation，IVF)。精液冷冻可大大提高种公畜的利用率，减少公畜的饲养量，节约成本且不再受地域、时间的限制。不仅有利于家畜品种改良，也是家畜育种和珍惜濒危物种保护的有效技术手段。总之，精液的冷冻保存对人类生殖医学、家畜繁殖育种及保护濒危野生动物等方面都有重要意义1,2。1 猪精液冷冻保存研究简史Polge等首先发现甘油对牛精子具有冷冻保护作用3，

3、依据此原理，Polge在1950-1960年间将牛精液冷冻方法用于猪精液冷冻保存，解冻后的猪精子具有活力，但没有受精能力4，1970年，他又向母猪输卵管中直接注入冷冻解冻后的猪精子，并最终获得仔猪5。随后Pursel and Johnson通过试验证实猪精子在冷冻解冻后仍然具有一定的受精能力6。猪颗粒和细管冷冻精液自1975年开始在商业中得到应用7，但猪精子自身具有其特殊性，它对降温非常敏感，冷冻解冻后异常精子数较多、精子活力及受胎率较低，鉴于以上原因，目前猪冷冻精液在实际生产中并未得到广泛应用，现仍以鲜精或液态保存精液为主，冻精用于猪人工授精的使用率不足1%。猪冷冻精液一般用于省际或国际间的

4、品种改良8。从1985年至今，学术界已经召开了五次关于猪精液冷冻保存的国际性会议，极大的推动了猪精液冷冻保存技术的发展。直到今天，颗粒和细管冻精或其它改进过的冷冻剂型仍在普遍使用，但由于繁殖成绩不理想，猪冷冻精液未得到大范围推广。Almlid and Hofmo9用解冻后精液和液态保存精液进行对比试验，结果证实前者输精后的母猪较后者的产仔率低20%30%；而窝产仔数则少23头。Eriksson 等10用5 ml扁平细管制作猪冷冻精液并出口，解冻后精子活力为49%53%，质膜完整率平均为60%，产仔率达到73%，平均窝产仔数达10.7头。我国于1954年在广西率先开展了人工授精试验，后经过反复实

5、践和改进，此技术得到了一定的推广和应用。1975年，西北农学院与西安草滩农场将解冻后精液试配了8头母猪，有4头产仔，平均窝产仔数为8.9头，取得突破性进展11。后来在一些省市相继获得成功，人工授精技术得到了广泛的推广和应用，并取得了一定的成绩。2 猪精液冷冻过程中的冷冻保护剂添加2.1卵黄Phillips 等12通过试验证实卵黄在精液冷冻保存中可以起到较好的抗冻作用，卵黄能附着于精子表面，对精子质膜和顶体均有较好的保护作用。而卵黄起保护作用的有效成分是低密度脂蛋白（LDL），其作用机理可能是卵黄LDL中的磷脂进入精子质膜和顶体外膜中，使膜的稳定性增强，进而对精子进行保护。卵黄一般添加量为20。

6、目前稀释液中添加的卵黄一般为鸡蛋卵黄，研究者已经尝试用其他禽类卵黄代替鸡蛋卵黄用于猪精液冷冻保存。Bathgate 等13研究了用鸭蛋和鹌鹑蛋卵黄替代鸡蛋卵黄用于猪精液冷冻保存，解冻后对精子质量进行评估，结果表明，鸡蛋卵黄组在刚解冻时具有较高的精子活率，而解冻后37培养36小时的结果显示不同卵黄之间对冻后精子活率没有显著影响。与鹌鹑蛋卵黄组相比，鸡蛋卵黄组和鸭蛋卵黄组在刚解冻时获得了很高的顶体完整率，在培养6小时后，鸡蛋卵黄组的精子顶体完整率下降速度较慢，而鸭蛋卵黄组顶体完整率显著下降。Fraser等14将从鸵鸟卵黄中分离出的脂蛋白（LPFo）与乳糖和甘油配制成冷冻稀释液，用于猪精液冷冻保存。

7、检测冻后精子质量，并进行输精试验，受胎率为75%，平均窝产仔数达10.5头。2. 2渗透性和非渗透性冷冻保护剂渗透性冷冻保护剂能够穿透细胞膜进入细胞内部，从而使溶液的浓度降低，细胞的渗透性肿胀减轻，通过减缓细胞皱缩和减少冰晶形成最终达到保护精子的目的。如甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、DMF和DMA等。非渗透性冷冻保护剂不能透过细胞膜进入细胞内部，它可以使细胞外的渗透压升高，细胞内部的水分向外渗透而使细胞皱缩，胞内冰晶的形成减少，而且还可以在细胞膜外部形成一层保护膜，使精子细胞得到保护。目前研究较多的非渗透性保护剂为双糖和多糖。双糖如海藻糖、蔗糖、乳糖和糊精等，尤其海藻糖对细胞的保护效果显著，

8、它通过在细胞膜周围形成的保护膜来抑制膜上胆固醇和磷脂的遗失，从而保护了细胞膜的磷脂双分子层，对细胞起到了较好的冷冻保护作用15-17。胡建宏等18研究表明在猪精液冷冻稀释液中添加一定浓度海藻糖对提高冷冻解冻后精子动性能以及顶体和质膜的完整性均有显著的作用。多糖如红景天多糖、海带多糖、绞股蓝多糖和枸杞多糖等，均获得了较好的冷冻保护效果。2. 3其它冷冻保护添加物质在冷冻稀释液中添加低密度脂蛋白、透明质酸、维生素、大豆卵磷脂、安钠咖、肝素、牛血清白蛋白、OEP、抗氧化剂（丁羟基甲苯、半胱氨酸、谷胱甘肽和亚牛磺酸等）、中草药抗冻剂和激素等抗冻保护物质，对提高冻后精子质量起到了一定的作用。3 精液品质

9、检测指标3.1精子密度和形态学检测最初借助光学显微镜对精子密度进行评定，将精液分为密、中、稀三个等级，此为定性分析，具有较强的主观性；而定量分析可以测定每毫升精液中的精子数目，更加客观准确，一般可使用密度比色仪和血细胞计数板进行分析19。精子形态学检测一般分为精子畸形率和顶体异常率的检测，它们决定了精子受精能力的高低。精子畸形率一般通过高倍显微镜进行观察评价，主观性较大。为了克服这一不足，人们开发了精子形态自动分析系统(ASMA)。精子顶体异常率一般采用姬姆萨染色或荧光染色法来检测20。3.2精子活率检测精子活率是指活精子数占总精子数的百分比，一般采用染色法进行评定，或直接在光学显微镜下观察，

10、统计运动精子的数量，计算其与总精子数的比值。3.3精子活力检测一般在光学显微镜下主观评价精子活力(直线运动精子百分率)。我国要求冻后精子活力达到0.3以上才可用于人工授精。由于评定主观性较强，目前对精子活率进行定性和定量分析时多采用计算机辅助精液分析技术（CASA）。定性分析主要包括精子直线运动速率（VSL）、平均运动速率（VAP）和精子头部侧摆幅度（ALH）等；定量分析是指直线运动精子的数量与总精子数的比值（PM）；这在很大程度上克服了精子活率评定的主观性，提高了检测的准确性。近些年研究人员将MTT还原法用于精子活率评定。MTT是一种四氮唑溴盐，其四氮唑环能与活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶作用

11、而被还原为不溶于水的蓝色结晶甲躜（formazan）并沉淀在细胞中，而死细胞则无此功能。利用这一特性可进行精子活率检测。Hazary等21将MTT法用于家禽精子质量评估，证明MTT法较INT还原法稳定性好，且与精子受精能力存在很强的相关性。Nasr-Esfahani 等22将MTT法用于评估人精子活率，并与曙红-苯胺黑染色法和HOST法进行比较研究，证明MTT法可有效检测精子活率，具有很高的灵敏性和特异性。Aziz23用MTT法评价马和牛的精子活率，得出此法快捷、灵敏度高、经济实用，可用于常规精液品质检测。而MTT法用于检测猪精子活率尚未见报道，可以进行一些探索研究。3.4精子质膜完整性检测精

12、子质膜对维持自身稳定和完成获能及受精等非常重要24，但质膜又是精子在冷冻保存过程中最易受到破坏的部位25，精子质膜的损伤会导致其生存力和受精力的下降。研究发现，冷冻保存往往造成精子发生一些获能样变化26。活精子质膜具有选择透过性，而死精子质膜则完全丧失。检测精子质膜完整性可以间接评定精子的死活。3.4.1常规染色和荧光探针检测常规染色检测质膜完整性的原理为：死精子质膜丧失选择通透性，染料可进入精子内部对其进行染色，但无法将活精子染色。常用染料有伊红、赤藓红、台盼兰、苯胺黑、姬姆萨、快红、苯胺兰等。它们均对精子具有一定的毒害性，对检测结果造成偏差。目前使用较多的活精子特异性荧光探针有：Hoech

13、st33342、羧基荧光素双醋酸盐（CFDA）、SYBR-14、荧光素双醋酸盐（FDA）、羧基二甲基荧光素双醋酸盐（CMFDA）和钙黄绿素乙酰基甲基酯（CAM）等。CMFDA、FDA、CAM及CFDA都是非荧光物质，均能进入活精子细胞内部，发生水解反应，在紫外光激发下，反应产物发出绿色荧光；SYBR-14及Hoechst33342为荧光染料，它们透过活精子细胞后，经过紫外光激发后可以直接发出荧光27。Hoechst33258、溴化非啶二聚体（EH）、碘化丙啶（PI）及溴化乙啶（EB）均为死精子特异性荧光探针，活精子无法与这些探针相结合，它们透过死精子的质膜进入细胞后，可以与细胞核DNA相结合，

14、在紫外光激发下发出荧光。现在一般使用荧光显微镜或流式细胞仪，将死精子及活精子特异性荧光探针相结合，使死精子与活精子同时得到鉴定。SYBR-14与PI相结合探针标记技术已经在精子质量评定中得到了广泛的应用。而使用FITC-Annexin V和PI对精子进行双标记检测法也被用于评定精子质量，有研究者利用此方法并借助荧光显微镜或流式细胞仪对精子质膜完整率及凋亡率进行检测28。3.4.2低渗肿胀检测(HOST)低渗肿胀检测原理为：正常精子质膜完整，可以维持其渗透压的平衡；而死精子则完全丧失膜选择透过性。低渗溶液（果糖-柠檬酸钠溶液）能够进入精子细胞内部，质膜完整的精子为了维持其渗透压的平衡，顶体会出现

15、一定程度肿胀，造成尾部不同程度的弯曲。借助普通光学显微镜可以计算弯尾精子百分率，即为质膜完整率，而死精子没有明显的形态变化。3.5精子线粒体活性检测精液在冷冻保存过程中会引起精子线粒体的损害，导致精子受精能力的下降。ATP为精子运动的供能物质，它主要产生于线粒体中，因此精子线粒体活性和其运动能力之间存在着很强的相关性，通过检测精子线粒体活性可以对精子质量进行评估。研究者很早就提出精子尾部运动的能量来源于ATP，精子中ATP水平是反映精子受精能力的标志，因此通过对ATP浓度进行检测，研究精子活力与ATP浓度之间的相关性，进而对精子受精能力进行预测。但至今对该方法仍存争议。目前检测线粒体活性使用较

16、多的为荧光探针检测法。常用的特异性荧光探针为MITO、JC-1和罗丹明123（Rh123）。Rh123具有快速和固染特点，并且不受温度变化的影响29。它与MITO均可根据线粒体膜电位在线粒体部位聚集，经紫外光激发后发出绿色荧光。线粒体膜电位由于线粒体功能状态的不同而呈现不同的分布，JC-1在线粒体低电位处形成单体，在高电位处则形成聚合体，经紫外光激发后分别发出绿色和红色荧光。JC-1在形成聚合体时还依赖于溶液离子强度、PH值、染料浓度和温度等条件。JC-1比MITO和Rh123探针更能准确的判断线粒体活性30。目前这些探针多与PI结合使用，广泛应用于精液品质检测。3.6精子顶体完整性检测精子头

17、部的大部分区域被顶体所覆盖，而穿透卵丘及透明带的水解酶也都包含在顶体中，如果顶体被破坏，造成顶体中酶类丢失，精子将无法穿越透明带使精子质膜与卵细胞膜相融合，无法完成受精过程。所以检测精子顶体完整率对于评定冻后精液品质十分重要。目前可以使用考马斯亮蓝染色法，借助光学显微镜对精子顶体完整性进行观察评定，此法简单方便。但如果要更加准确地检测精子顶体状态还需使用免疫荧光染色法。检测时一般使用异硫氰荧光素（FITC）与免疫结合物（主要为一些植物性凝集素和CTC等）相结合标记方法。非渗透性的植物性凝集素能够结合活精子顶体的相连物。目前常用植物性凝集素有：花生凝集素（PNA）、豌豆凝集素（PSA）、伴刀豆素

18、（Con-A）、UEA、RCA、WGA和Lyso Tracker TMGreen DND-26等31。尤其是PNA和PSA已得到广泛应用32。而CTC能够渗透进入死精子，特异性结合精子顶体内的抗原。另外还可通过透射电镜对精子顶体进行检测，此法结果真实33，原理为：若顶体正常，则观察到顶体外膜完整，顶体内膜与质膜连续；若顶体已经发生真顶体反应（TAR），则观察到顶体外膜出现规则性断裂，顶体内膜与质膜相融合；若观察到顶体外膜出现不规则断裂，尽管顶体内容物仍然存在，但顶体发生的是假顶体反应（FAR）。但此法检测所需设备价格昂贵，而且制备样本的过程比较复杂，因此目前并未被大部分实验室所采用。3.7精子

19、核DNA损伤检测冷冻降温会造成精子DNA链的断裂，从而影响精子的受精能力，因此检测精子核DNA完整性意义重大。这里主要介绍使用最为广泛的荧光染色标记法和彗星试验检测法。3.7.1荧光染色标记法Hochest 33342和33258为特异性DNA荧光探针，用紫外光激发后发出蓝色荧光，可用于标识染色质凝集程度，借助荧光显微镜或与相差显微镜共同使用，检测凋亡精子高度凝集和边缘化的染色质特征，研究其与受精力的相关性。丫啶橙（AO）染色也可用于检测DNA的损伤。DNA变性后，用AO进行染色，损伤的DNA会在紫外光激发下发出荧光，用荧光显微镜观察DNA损伤情况34。3.7.2彗星检验彗星检验（Comet

20、assay），又称单细胞凝胶电泳（SCGE）。该检测方法可以对DNA单链及双链的断裂情况进行定量测定，从而对冻后精子DNA损伤进行评估。彗星检验法具有灵敏、简便等优点，已被广泛用于检测细胞DNA完整性。此法于上世纪70年代末建立，后经过一系列改进和完善。直到上世纪90年代中期，研究者将彗星检验法应用于评价精子DNA损伤。徐德福等35通过对该检测方法进行改进，借助荧光显微镜成功观察了人精子核DNA单链及双链的断裂情况。此外，还可以通过精子染色质结构分析（SCSA）、精子染色质扩散试验（SCD）、原位末端标记法（ISEL）和荧光原位杂交法（FISH）36等方法对精子DNA损伤进行检测。3.8精子获

21、能检测钙离子内流入精子细胞，使精子质膜的结构发生改变，细胞内部pH值升高，精子完成获能后最终发生顶体反应。精子在冷冻保存过程中，钙离子浓度及其分布可以有效地反映精子的获能情况。检测精子获能常用的荧光染料为氯四环素（CTC），又称金霉素。它能在钙离子浓度较高部位积累，形成氯四环素-钙离子复合物，此复合物易与精子细胞膜内的疏水区结合，在紫外光激发下发出荧光。这种结合依赖于钙离子浓度及其分布状态。借助荧光显微镜检测精子获能情况和精子膜离子浓度、膜表面积等指标。目前CTC染色已得到广泛应用。3.9精子受精能力检测精子受精能力检测能对冷冻解冻后精液进行人工授精和体外受精的效果进行更加准确和直观的评定。3

22、.9.1透明带结合检测检测精子结合透明带能力有两种方法：一种是将精子和卵母细胞进行共孵育后，在荧光显微镜下计算结合到卵细胞透明带上精子的数量，称之为透明带结合检测（ZBA）；另一种是通过显微操作将卵母细胞切割分为两半，去掉细胞质。将两半的透明带与精液共培养，用相差显微镜观察统计结合到透明带上的精子数量，称之为半透明带检测（HZA）37。3.9.2体外受精（IVF）检测体外受精检测是预测精子受精能力的有效方法之一。精子质量检测最终目的是检测精子对卵母细胞的体外受精能力。龙翔和邰秀林38应用去透明带牛卵母细胞检测牛和马精子穿透能力。Shur等 39研究了用人精子穿透去透明带仓鼠卵母细胞来检测人精子

23、受精能力。由于只有经过获能和顶体反应的精子才能穿透卵母细胞，因此该检测可以评定精子获能情况和判断顶体反应的发生。3.9.3精子-输卵管互作检测有研究者在体外对精子-输卵管互作效应进行检测，从而对精子与输卵管相互结合的生理学机理及精子附着能力进行了深入的研究。妊娠率是衡量精液质量的最终指标，在体外建立精子与输卵管附着模型，通过研究精子与输卵管上皮的附着数量进而评价妊娠率的高低。3.10精子酶活力检测早在上世纪70年代精子酶学在冷冻精液的品质评定及受精过程中的调控作用就引起有关学者的极大关注。精子在冷冻保存过程中会受到不同程度的损伤，精子超微结构受到破坏，导致质膜通透性增强，使精子内部的酶类从细胞

24、膜逸出进入精浆。研究者通过试验证实精子顶体酶含量在精液冷冻后呈现增加的趋势，并证明通过检测顶体酶含量可以评估精子活力及顶体完整性40。陈田飞等41对超氧化物歧化酶（SOD）在家蚕精液冷冻保存前后的变化情况进行研究，结果证实精液中SOD酶活性随着时间延长呈现下降的趋势。张婷42研究了猪精液冷冻前后SOD、CAT和GPx酶活力的变化，发现整个冷冻过程中，精子内三种酶活力均呈下降趋势。潘巧莲43研究了猪精液冷冻前后SOD、LDH、GOT酶活力变化情况。这些酶类在精子发生和受精过程中均起着重要作用，研究者将酶活性检测用于评定精液品质和预测受胎率，取得了一定的成果。将来的研究方向是进一步确定哪些酶类与精

25、子品质高度相关，通过研究酶类的变化进而更好的揭示精子冷冻保存机理。参考文献l Barbas JP,Masearenhas RD.2009.CryoPreservation of domestie animal sperm cellsJ.Cell and TissueBanking，10(l):49-62.2 Mazur P，Leibo SP，Seidel GE.2007.CryoPreservation of the Germplasm of Animals Used inBiological and Medieal Researeh: Importance，Impact，Status，and

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