大鼠肝细胞线粒体形态的三维重建.

1、大鼠肝细胞线粒体形态的三维重建目的 研究同一细胞内不同形态线粒体的数量、大小和 方法 用三维重建和体视学测量的方法，研究成年大鼠肝细胞线 结果 肝细胞线粒体按形态可分为5个基本类型：1型（球【摘要】 超微结构。粒体的形态类型。形、椭球形和盘状）线粒体约占线粒体总数的21.4%；n型（杆状）约占32.4%;m型（不规则形）约占23.8%,V型（分支形）约占19.6%,V型（出芽形）仅占 2.8%。1V型线粒体的平均体积分别为 0.11、0.21、0.32、0.51和0.64 im3。体现学分析显示，各型线粒体的体积密度有差异（P v 0.05或Pv0.01） ,n型线粒体体积密度最大，然后是m、

2、v和I型，V型线粒体体积密度 最小。i、n和V型线粒体嵴膜密度均高于m或V型（Pv0.05）。 结论 肝细胞内不同形态的线粒体都占有一定的比例，他们不仅体积差异很大，其超微结 构亦有不同。【关键词】 肝细胞 线粒体 三维重建 体积密度 膜密度THREE-DIMENSIONAL RECONSTRUCTION OFMITOCHONDRIA IN RAT HEPATOCYTEMu Cha ngzhe ng, Xi Huanjiu , Bao Cuife n, Liu Xia,Erik IIS* *Christensen * *, Cui Shiying(Department of Histology

3、 and Embryology,* Department of Anatomy,Jinzhou Medical College,Jinzhou;*Department of CellBiology, Institute of Anatomy,AarhusUniversity, Denmark)【Abstract 】 Objective To examine the number,size and ultrastructure of the different forms of mitochondria in a cell. Methods Morphological types of the

4、mitochondria in rat hepatocyte were studied by three dimensional reconstruction and stereological analyses. Results The mitochondria may be classified into five basic types according to their morphological characteristic.The numbers(%)of typeI (sphere, ellipses anddisc),typen (rods),type E (irregula

5、rs),typeIV (branches)andtype V (budding)were 21.4%,32.4%,23.8%,19.6% and 2.8%,respectively.Andtheir average volume were 0.11叩3,0.21 叩3,0.32 叩3,0.51 叩3 and0.64 Jim3, respectively. Stereological analyses showed that there were significant difference in volume,density and crista membrane density among

6、five types of mitochondria(Pv 0.05 or P v 0.01).The volumedensity of mitochondria type n was the highest,that of typeV thelowest and that of type 川,type IV and type I the medium.Mitochondrial cristamembrane density of typeI ,type n andtype V was higher than both that of type川 and type V. ConclusionE

7、ach type of mitochondria kept a suitable proportion in normal rat liver cell.There were significant difference not only in volume among different forms of mitochondria,but also in ultrastructure.【Key words】 Hepatocyte; Mitochondria; Three-dimensional reconstruction; Volume density; Membrane density线

8、粒体在生长过程中以及在不同的生理或病理状态下，其形态会发生很大 改变3。自60年代以来，各种细胞线粒体微细结构的研究报道甚多，但对同 一细胞内线粒体形态结构和功能差异的研究较少。我们利用三维重建技术研究 大鼠肝细胞线粒体的立体形态，并对其体积密度和嵴膜密度进行体视学测量， 为研究线粒体的结构与功能变化提供了形态学依据。材料和方法雄性 Wistar 大鼠 5 只，体重 200320g, Inactin（Bjk-Golden,Knostanz,FRG）腹腔注射麻醉（150mg/kg）。以140mmH的压力经腹主动 脉灌注1%t二醛（溶于0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液中，PH7.2），20min后

9、，摘 除肝，切取肝组织块，2.5%戊二醛继续固定1h。再以1%锇酸（溶于0.1mol/L巴 比妥-醛酸缓冲液中，PH7.2）后固定1h，逐级酒精脱水，环氧树脂 Epon 812包 埋。每只大鼠取3个肝组织块，每块组织在 LKB Ultrotome m型超薄切片机上 切1组连续切片，分别收集在贴有 Formar膜的单孔铜网上。枸橼酸铅染色2min,醋酸铀染色10min。JEOL JEM-1200EXfe子显微镜观察。电镜下，在每组连续切片中，随机选取 3个肝细胞进行连续观察。在放大 10 000倍的条件下，对选定的肝细胞以蒙太奇法进行全细胞摄片，洗印时放大 3 倍，通过照片组合制成完整的肝细胞照

10、片。组合后的肝细胞照片数与其相应 的连续切片相等，即每个肝细胞制成 1 组与其连续切片相应的照片。校正仪器 放大倍数后，测得照片实际放大倍数为 28 92029 600 倍。通过测量球形小泡 （内吞泡、溶酶体等 ） 的直径和球形小泡的连续切片数，计算切片厚度（切片厚度=球形小泡直径 /球形小泡连续切片数 ）4。各组连续切片的厚度为 38.5 51.0nm。在每个肝细胞的 1 组连续切片照片中，取其中位数照片上的所有线粒体为 观察对象 （例如：1 个细胞连续切片 55张，第 28张即为中位数切片。其上如有 线粒体 105个，该 105个线粒体则全部为观察对象 ） 。通过连续切片观察分析每 个线粒

11、体的立体形态，按随机原则从中选取 10个线粒体用于三维重建。重建 时，根据每个肝细胞切片厚度的不同，分别选用不同厚度的胶板（胶板厚度 =平均切片厚度X照片实际放大倍数），以连续切片照片中的线粒体为模板，按其原 位重建三维模型。本研究共观察线粒体总数 29 010 个（来源于 5只大鼠），重建 线粒体模型 450 个。应用点计数法，通过方格测试系统测量线粒体体积密度，嵴膜密度，以及 其他细胞器的体积密度 5。利用模型排水法测量线粒体模型的体积，再除以其 放大倍数的 3 次幂，得出实际线粒体体积 6。1. 线粒体的形态类型连续切片的观察分析和三维重建术显示，肝细胞线粒体形态多样，按其形 态特征可划

12、分为5个基本类型，i型为球形、椭球形和盘状；n型为杆状；m 型为不规则形；W型为分支形；V型为出芽形 （15）。在每个肝细胞中，各型 线粒体都占有一定的比例，其中以n型线粒体最多，其次为m型、W型和I 型，V型线粒体数量最少（表1）。2. 线粒体的体积、体积密度及嵴膜密度通过线粒体模型测量的线粒体体积总均数为0.29 ym3。各型线粒体体积差异显著（P0.01）。线粒体体积与形态有很大关系，一般讲，形态越复杂者体积 越大（表1）。体视学分析显示，成年大鼠肝细胞线粒体体积密度明显高于其他 膜相结构的体积密度（P 0.01）。线粒体体积占肝细胞胞质体积的18.6%（表2, 6）。分析还显示，各型线

13、粒体的体积密度有所不同，除I型与W型无差异外， 其余两两比较均有差异或显著差异（P 0.05或PV0.01）。其中n型线粒体体积 密度最大，然后是m型、W型和I型，V型的体积密度最小（表1）。表1各型线粒体形态计量参数Table 1 Morphometric p arametor of differe nt types of mitocho ndria类 型ty p e数量 与百 分数(%) numb er and perc en ta ge平均体积(ym3)average volume s体积密度(ym0)volume den sity s X 100嵴膜密度( ym1)crista mem

14、bra ne den sity s I6208 (21.4)0.11 0.0283.31 0.06*4.88 0.89n9339 (32.4)0.21 0.0485.85 0.75*5.02 0.97m6905 (23.8)0.32 0.0564.76 1.093.69 0.74 *W5686 (19.0.51 0.0173.91 0.273.85 0.68 *6)V812(2.8)0.64 0.0540.72 0.165.14 1.02 *各型线粒体平均体积每两者相比均有显著差异参照系为胞质，除I与W两者比较外，其他两者相比，Pv 0.01Pv 0.05 或 Pv0.01参照系为线粒体，*

15、*表示与*比较有差异PV 0.05Significant differenee of average volume(Pv 0.01)was detectedamong all the typ es. Referenee system is cytoplasm.Significant differenee (Pv 0.05or P v 0.01) was detected among all the types.exceptI and IV. Refere nee system is mitocho ndria.*rep rese nt sig nifica ntdiffere nee at P

16、v 0.05,as comp ared to *.表2大鼠肝细胞胞质体积密度Table 2 Volume den sity of the cytop lasm in rat liver cell结构成 分structure comp osi tio n s X 100结构成 分structu recomp osi tio n s X 10C线粒体mitochondria18.6 2.4溶酶体 lysosom e2.2 0.5滑面内 质网smooth endopla smic reticul um13.7 3.8糖原 glycoge n13.7 4.3粗面内 质网 rough endoplasm

17、ic reticul um7.7 1.7脂滴fatdrop1.5 0.9咼尔基 复合体Golgi comp lex2.1 0.7基质stroma40.2 6.9参数系为胞质，n=5 Refere nee is cytop lasm ,n=5线粒体嵴膜密度分析表明，各型线粒体间有所不同，其中I、n、V型之 间无显著性差异，m、v型之间亦无显著性差异，而I、n、V型与m、v型 比较，每两两之间均有差异（P 0.05），v型线粒体嵴膜密度最大，V型线粒体 嵴膜密度最小，其余各型居此两者之间（表1） 012345I型（球形、椭球形和盘状）线粒体三维重建模型 n型（杆状）线粒体三维重建模型m型（不规则形

18、）线粒体三维重建模型W型（分支形）线粒体三维重建模型V型（出芽形）线粒体三维重建模型Fig.1 Three-dime nsio nal models of mitoch on dria typec).dime nsional models of mitoch on dria typedime nsional models of mitoch on dria typedime nsional models of mitoch on dria typedime nsional models of mitoch on dria typen (rods). m (irregulars).IV (bra

19、 nches).V (budding).I (sphere,ellipese and disFig.2 Three-Fig.3 Three-Fig.4 Three-Fig.5 Three-6正常大鼠肝细胞N.细胞核 m.线粒体标尺示1 mFig.6 Normal rat hep atocyte.N: nu cleus,m:mitocho ndria Bar=1早在60年代即证实肝细胞线粒体具有多样性和可变性。近年的研究表明： 小鼠胚着床前线粒体由球形向椭球形和长杆状转变;发育不同时期的肾小管和肠上皮细胞内线粒体变化也很大，即由简单的球形、椭球形向复杂的分支形 转化15。一般认为，线粒体常以出芽

20、方式生长，以分裂方式增殖，这都会导致 形态变化。本研究通过连续切片的观察及重组线粒体三维模型，进一步证实了 肝细胞线粒体形态的多样性。除球形和椭球形外，还有相当数量的不规则形、 分支形和出芽形，这表明正常肝细胞内同时存在着发育不同阶段的线粒体。我 们根据线粒体的形态特征，并参考前人的研究成果8，将线粒体划分5种类型。传统观点认为，哺乳类动物每个肝细胞内大约有1 0002 000个线粒体,这种估计是基于二维像分析的结果，由于忽略了线粒体断面之间的联系，常错 把一个不规则形或分支形的大线粒体当成几个线粒体来处理，因此，其数据常 常有偏差。我们通过连续切片观察，认为肝细胞线粒体形态多样，其数量仍需

21、进一步准确测定。已有研究表明，正常肝细胞内各型线粒体均占有一定的比 例，当肝细胞处于不同的生理或病理状态时，这种比例可能会发生改变 2，3 例如，随着年龄的增长，线粒体数量减少，不规则形和分支形线粒体比例增大 8。某些病理情况下，线粒体不仅数量减少，嵴膜异常和膨胀也引起外形的改 变，从而使各型线粒体比例发生变化 3。肝细胞内不规则形和分支形线粒体占有相当的数量，用直径表示线粒体的 大小是不准确的。本研究利用模型排水法测量线粒体体积，尽管其结果与实际 体积尚有差距，但对于比较各型线粒体的大小来说还是很有意义的。体积密度 尽管不能表示线粒体的实际大小，却能在一定程度上反映细胞内线粒体的含 量。如肝

22、细胞内V型线粒体平均体积最大，但因其数量甚小，因此其体积密度 最小，n型线粒体平均体积虽小，但其数量最多，所以体积密度最大。一般认为，线粒体嵴的多少能反映其氧化磷酸化程度，进而反映线粒体的 功能状态。本研究显示，肝细胞内i、n和V型线粒体嵴膜密度都明显高于 m或W型，这表明前三者的功能状态明显比后两者活跃。n型线粒体数量最 多，体积密度最大，功能很活跃，我们推测它们可能是肝细胞最主要的能量提 供者。从体积大小、功能状态及线粒体发育特点上看，i型线粒体可能是较为 幼稚的线粒体，m和W型线粒体可能是成熟的或接近衰老的线粒体，V型线粒 体则处于出芽生长阶段。总之，肝细胞内各型线粒体都占有一定的比例，

23、由于 处于不同的生长阶段，因此不仅体积不同，其功能状态亦有所差异。*o* *o作者单位：穆长征 席焕久？包翠芬 刘霞 Erik IISChristensen?崔士英锦州医学院组织学胚胎学教研室， ?解剖学教研室，锦州121001；奥尔胡斯大学解剖学系细胞生物学研究室，丹麦 参考文献1 韩贻仁，赵晖 . 小鼠胚着床前线粒体的分布和超微结构变化. 解剖学报，1998，29(3) ： 3032 Beretiter-Hahn J.Dynamics of mitochondria in living cell:shape changes dislocation,fusion,and fission of mitochondria.Microse Rec Tech,1994,27(3):1983 Sherratt HS.Mitochondria:structure and function.RevNeurol(pairs),1991:147(6-7):4174 Cui SY,Chri