实验五小鼠骨髓染色体的制备与C带染色课件

1、实验五小鼠骨髓染色体的制备与C带染色实验八：小鼠骨髓染色体的制备实验八：小鼠骨髓染色体的制备与与C带染色带染色实验五小鼠骨髓染色体的制备与C带染色一一.小鼠骨髓染色体的制备小鼠骨髓染色体的制备n学会小鼠骨髓染色体标本的制备学会小鼠骨髓染色体标本的制备【实验目的】【实验目的】实验五小鼠骨髓染色体的制备与C带染色【实验原理实验原理】n处于分裂期的细胞经秋水仙素处理,由于阻断了纺锤丝微管的组装,使细胞分裂停止于中期,此时染色体达到最大收缩,具有典型的形态。n本实验所用的小鼠骨髓细胞具有高度的分裂活性并且数量非常多,经秋水仙素处理后,可使分裂的细胞阻断在有丝分裂中期,再经低渗、固定、滴片染色等处理,便

2、可制作较好的小鼠骨髓细胞染色体标本。实验五小鼠骨髓染色体的制备与C带染色【仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂】n（一）仪器显微镜,温箱,冰箱,离心机,天平。n（二）材料（二）材料n解剖器皿(解剖盘,剪刀,镊子),注射器(1mL),4号针头,6号针头,纱布,脱脂棉,酒精灯,试管,试管架,滴管,50mL烧杯,染色缸,洗耳球,量筒,载玻片(实验前将载玻片浸入50的酒精溶液中,置4冰箱中至少1h)。n（三）试剂（三）试剂n0.85生理盐水,冰醋酸,甲醇,Ph6。8PBS,Giemsa染液,75酒精,蒸馏水,秋水仙素(1mg/mL),0。075mol/lKCl。实验五小鼠骨髓染色体的制备与C带染色n1秋水

3、仙素:以1mg/mL的浓度溶于0.85生理盐水中。n2低渗液: 0.075mol/lKCl取5.59gKCl加到1000mL蒸馏水中,在37下预热。n3固定液:甲醇:冰醋酸以3:1配制(新鲜的)（三）试剂（三）试剂实验五小鼠骨髓染色体的制备与C带染色【实验步骤实验步骤】1.取雌雄小鼠各一只,注射秋水仙素0。1mL于腹腔中,经3。5-4h后拉颈椎处死。2.剪开腹腔,剥离出两条后肢,由股骨关节处剪断,取下后肢(注意不要将股骨剪断)。3.将骨骼外面的肌肉尽可能剪掉,剩下附着在骨骼上的少许肌肉,用棉花或纱布蘸75酒精来回搓,直到骨骼外面不带任何肌肉为止。4.剥离股骨,并将股骨头的两端减去少许,然后用4

4、号针头插入骨髓腔内,将股骨穿通(注意:不要用力过大,以防骨骼破裂)。实验五小鼠骨髓染色体的制备与C带染色5.将带6号针头的1mL注射器插入骨髓腔1/2部位,然后将股骨浸入含0.85生理盐水的离心管内,操纵注射器将骨髓细胞全部冲洗到离心管内,直至骨髓腔呈白色为止。然后丢弃股骨,换4号针头轻轻抽打离心管内的细胞,尽可能使其分散。6.将细胞悬液1000r/min离心8-10min,弃去上清液。7.低渗处理:向细胞中加入5mL在37预热的0.075mol/lKCl溶 液,用吸管轻轻抽打均匀,置37水浴低渗处理15min.【实验步骤实验步骤】实验五小鼠骨髓染色体的制备与C带染色8.在低渗处理期间,配置固

5、定液,即3:1的甲醇:冰醋酸,放在密闭的瓶中,置4冰箱中备用。9.预固定:低渗处理后,立即加入1mL新配制且预冷的固定液,抽打均匀,然后1000r/min离心8min,弃去上清液。10.固定:沿离心管壁慢慢加入新配制的固定液5mL,用吸管轻轻抽打均匀,室温下固定30min。 1000r/min离心8min,弃去上清液。【实验步骤实验步骤】实验五小鼠骨髓染色体的制备与C带染色11.再固定:再次加入固定液5mL,抽打均匀后,置于4冰箱中固定30min或更长时间,必要时也可过夜。 1000r/min离心8min,弃去上清液。12.根据管底细胞的多少,加入新配制的固定液0.3-0.5mL, 用吸管轻轻

6、抽打均匀,形成细胞悬液。13.制片:将预冷的载玻片倾斜45度角, 用吸管取细胞悬液,从约1.5m高处,向每张载玻片上滴1-2滴,立即用口吹散,然后用镊子夹住载玻片的一端,立即放酒精灯火焰上过几遍。【实验步骤实验步骤】实验五小鼠骨髓染色体的制备与C带染色14.染色:将载玻片平放在染缸内,自然干燥或用吹风机吹干,以Giemsa染液染色,根据染色效果,染色6-10min后,用蒸馏水轻轻冲洗,并晾干。15.镜检:先用低倍物镜找出分散好的分裂相视野,再换高倍镜和油镜观察,细胞质被染成蓝色,细胞核被染成淡紫色。【实验步骤实验步骤】实验五小鼠骨髓染色体的制备与C带染色【注意事项注意事项】n1.注意小鼠雌和雄

7、的分辨:雌小鼠的生殖孔距离尿道口较近;雄小鼠的生殖孔距离尿道口较远。n2.骨髓细胞滴片时高度的掌握很重要,可在1-1.5m间进行预实验。n3.骨髓细胞滴片在酒精灯火焰上应多过几次,使胞膜和核膜充分涨裂,才能释放出染色体。n4.如果只做小鼠骨髓染色体制备,可省略11再固定;如果继续做C带染色,必须再固定。n5.Giemsa染色后,切勿先将染液倾去再冲洗,应在染液倾去前直接轻轻冲洗玻片,以免染液中细小颗粒附着于标本,影响观察。实验五小鼠骨髓染色体的制备与C带染色【实验报告实验报告】n1.找出你制备最好的几个分裂相视野,数出染色体条数。n2.画出你所看到的一个中期分裂相的图像。n3.总结制备成功或失

8、败的经验。实验五小鼠骨髓染色体的制备与C带染色【思考题思考题】n1.小鼠染色体形态上有什么特点?共有多少条?n2.微管特异性药物秋水仙素在本实验中的作用是什么?n3.简述有丝分裂4个时期的主要特点。实验五小鼠骨髓染色体的制备与C带染色二二.染色体染色体C带的制备带的制备【实验目的实验目的】学会小鼠骨髓染色体学会小鼠骨髓染色体C带的制备带的制备实验五小鼠骨髓染色体的制备与C带染色【实验原理实验原理】n借助特殊的燃料及染色程序,使染色体的一定部位呈现深浅不同的带纹,可用来鉴别染色体组,单个染色体以及深入认识染色体的结构和功能。 nC带可使着丝粒区,端粒区的异染色质及其他染色体区段的异染色质部分呈G

9、iemsa深染,其他部分呈淡染。 实验五小鼠骨髓染色体的制备与C带染色【仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂】n（一）仪器光学显微镜,冰箱,恒温水浴锅。n（二）材料n已制备好的小鼠骨髓染色体载玻片,染色缸,烧杯,镊子等。n（三）试剂n盐酸(0.2mol/l),5Ba(OH)2(50预热),2SSC溶液(60-65预热),Giemsa染液实验五小鼠骨髓染色体的制备与C带染色1.按上述小鼠骨髓染色体的制备步骤制备染色体滴片,注意滴片时多滴些细胞,且标明雌或雄。2.将老化3-7d的染色体标本,在室温下用0.2mol/l的盐酸处理1h。3.用蒸馏水轻轻冲洗3次。4.转入505Ba(OH)2溶液中温育12m

10、in左右。【实验步骤实验步骤】实验五小鼠骨髓染色体的制备与C带染色5.立即用自来水冲洗2min,再用温蒸馏水冲洗 2次,使Ba(OH)2被冲洗干净。6.将标本放入60-652SSC溶液中处理1h。7.用蒸馏水轻轻地冲洗载玻片,空气干燥。8.染色:用Giemsa染液染色5-8min。【实验步骤实验步骤】实验五小鼠骨髓染色体的制备与C带染色9.用自来水轻轻地冲洗,空气干燥或电吹风吹干。10.镜检:先用低倍物镜找出分散好,C带反差好的分裂相视野,再换高倍物镜和油镜观察,应看到C带区为深染,非C带区为浅染。【实验步骤实验步骤】实验五小鼠骨髓染色体的制备与C带染色【注意事项注意事项】n因老化,酸碱盐处理过程中都要损失一些细胞,所以骨髓细胞滴片时要多滴一些细胞,各步清洗都要轻些,否则将冲掉很多细胞。n必须严格控制老化的时间和温度,否则C带区和非C带区染色后的反差较小,分辨不清。nGiemsa染色的时间与周围温度和染料有关,可作预实验找出合适的染