RNAi沉默EGFR基因对卵巢癌放疗敏感性的影响

1、RNAi沉默EGFR基因对卵巢癌放疗敏感性的影响                      作者：林远洪 吴永忠 李少林 郭启帅 罗茜 【摘要】  目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)基因对卵巢癌放疗敏感性的增强作用。方法 构建针对EGFR基因序列特异性短发夹状RNA(shRNA)表达载

2、体，应用卵巢癌SKOV3细胞建立裸鼠移植瘤模型，随机分为对照组、单纯放疗组、基因放疗组，采用6 MV X线照射裸鼠瘤组织，监测瘤体积，测量瘤质量，取瘤组织行RTPCR、Western印迹、免疫组化、电镜检测。结果 治疗后三组瘤体积差异均显著(均P<0.01)，单纯放疗组、基因放疗组的抑瘤率分别为28.1%、46.1%，基因放疗组EGFR基因的表达明显下调，透射电镜下瘤组织凋亡、坏死最明显。结论 动物实验证实RNAi沉默EGFR基因明显提高卵巢癌的放疗敏感性()。 It is a small flock that has not a bla

3、ck.  【关键词】  EGFR基因;RNA干扰;放疗;卵巢癌Hide one's talents in a napkin.  【Abstract】 Objective To explore the effects of epidermal growth factor receptor (EGFR) gene on the radiosensitivity of ovarian&

4、#160;cancer by RNAi technology. Methods EGFR gene sequencespecific shRNA expression vector were constructed. Tumoranimal model with ovarian cancer SKOV3 cells were established and the&#

5、160;nude mice were randomly divided into control, radiotherapy and generadiotherapy groups. The ovarian cancer tissue was irradiated by 6 MV Xray. Tumor volume and tumor weigh

6、t were measured. RTPCR, Western blot, immunohistochemistry and electron microscopy were used to detected cancer tissue. Results There were obvious difference among three groups in&

7、#160;tumor volume (P<0.01). The inhibitingtumor rate of the radiotherapy and the generadiotherapy groups were 28.1% and 46.1% respectively. The expression of EGFR gene in genera

8、diotherapy group was significantly decreased and the tumor cell apoptosis, necrosis were all obvoius.Conclusions Silenced EGFR gene by RNAi can significantly improve the radiosensitivit

9、y of ovarian cancer.【Key words】 EGFR gene;RNA interference;Radiotherapy;Ovarian cancer 表皮生长因子受体(EGFR)的高表达与肿瘤恶性程度、转移、放化疗敏感度下降密切相关，可作为诊断及判断预后的指标，许多阻滞和下调EGFR的方法被用来抑制肿瘤增殖以改善预后，并已显示出初步疗效及良好的安全性，因此EGFR成为目前公认的肿瘤基因治疗的重要靶位1。本实验选择放疗相对不敏感的卵巢癌SKOV3细胞为研究对象，以目前分子靶向治疗中的

10、EGFR基因为靶点，采用RNA干扰(RNAi)技术，探讨EGFR基因与卵巢癌放疗敏感性的关系，实验初步显示了RNAi技术在卵巢癌基因放疗中的潜在作用，为肿瘤治疗提供新策略。1 材料与方法1.1 主要材料 卵巢癌SKOV3细胞株购自中科院上海细胞生物研究所;BALB/C雌性裸鼠购自北京维通利华公司。脂质体lipofectamine2000购自Invitrogene公司;去内毒素质粒提取试剂购自Omega公司;鼠抗EGFR单克隆抗体购自Santa Cruz公司;蛋白提取试剂盒购自赛百盛公司;免疫组化试剂盒及SDSPAGE凝胶购自博士德公司;总RNA提取试剂购

11、自华舜公司;RTPCR试剂盒购自宝生公司。1.2 方法None but a wise man can employ leisure well.  Time is money, but money is not time.  CUGCAA3;以此序列为基础,中间加入CUAUGGACA茎环序列将其分隔为反向重复序列，两端加上BamH和Hind酶切位点，送武汉晶赛生物工程公司合成。Self-confidence is the first requisite to human greatness.  1.3 统计学处理 采用SPSS 

12、;11.0统计软件，数据以x±s表示，计量资料用方差分析。2 结 果2.1 肿瘤体积变化 见表1，开始治疗时3组间瘤体积差异不显著(P>0.05)，治疗后3组间差异显著(P<0.01)，单纯放疗组与基因放疗组抑瘤率分别28.1%,46.1%。表1 放疗期间三组瘤体积变1)与对照组比较，2)与单纯放疗组比较：P<0.012.2 RTPCR检测EGFR mRNA的表达 见图1，基因放疗组中EGFR mRNA(425 bp)的亮度明显低于单纯放疗组及对照组，而内参GADPH

13、 mRNA(310 bp)在三组中的亮度相似，基因放疗组(0.317±0.071)与对照组(1.244±0.119)、单纯放疗组(1.179±0.086)差异显著(P<0.01)，基因放疗组的EGFR mRNA表达抑制率为74.5%。2.3 EGFR的蛋白表达 见图2，基因放疗组中EGFR蛋白(170 kD)表达的强度明显弱于单纯放疗组及对照组，而内参actin(42 kD)在三组中的强度相似，基因放疗组(0.254±0.034)与对照组(0.806±0.064)、单纯

14、放疗组(0.781±0.039)差异显著(P<0.01)，基因放疗组EGFR蛋白表达的抑制率为68.5%。2.4 免疫组化检测结果 见图3，EGFR蛋白在单纯放疗组及对照组中呈强阳性表达,胞膜及胞浆内见到大量棕黄色或棕褐色颗粒，而在基因放疗组中呈弱阳性表达或不表达，胞膜及胞浆内见少量棕黄色或棕褐色颗粒。He that runs fastest gets the ring.  2.5 电镜结果 电镜超微结构，图4，卵巢癌细胞质丰富、核仁明显、核分裂象多、核浆比大，放疗组较对照组肿瘤组织呈明显坏死改变，部分胞膜、核膜溶解、细胞核固缩

15、、细胞缩小、染色质浓缩、可见典型凋亡小体等，尤以基因放疗组最明显。Hide one's talents in a napkin.  3 讨 论RNAi是指由双链RNA引发的转录后基因沉默机制，它通过具有序列特异性的双链RNA(dsRNA)或短发夹状RNA(shRNA)与靶基因mRNA结合而导致目的基因表达下调，细胞表现出特定基因缺失的表型2，3。新近研究发现，RNAi在应用过程中，小片段干扰RNA(siRNA)可通过与目的基因具有同源性的其他mRNA结合，或者与细胞的蛋白结合，产生非特异作用，即脱靶效应导致基因沉默特异性降低3，相对传统的基因治疗，RNAi

16、具有高效性、高特异性、高稳定性、可遗传性、可扩散性等特点，目前RNAi在癌基因组功能研究和肿瘤基因治疗中已显示出强大的效果，siRNA表达载体因具有简便、快速、成本低、转染效率高，便于稳定筛选等优点，极大促进了RNA干扰技术的应用4。论文包括学年论文、毕业论文、学位论文、科技论文、成果论文等.  卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一，近年发病率呈上升趋势，卵巢癌发病隐匿,确诊时多为中晚期,目前卵巢癌虽综合了手术、化疗、放疗、免疫、热疗等多种手段，但疗效并不乐观。近年来随着分子生物学的发展，有学者研究表明70%以上的卵巢癌组织中有EGFR高水平表达5，6，EGFR在恶性肿瘤中过表达，使癌细胞抵

17、抗电离辐射7，导致放疗失败。论文既是探讨问题进行科学研究的一种手段，又是描述科研成果进行学术交流的一种工具.  本课题将RNAi技术与目前国际上有关辐射信号转导途径的研究结合起来，采用RNAi技术阻断导致辐射抗拒性的信号转导途径上的关键基因家族，深入探讨RNAi技术增敏放疗的内在分子机制。实验选择放疗相对不敏感的卵巢癌SKOV3细胞为研究对象，以目前分子靶向治疗中的EGFR基因为靶点，探索其对卵巢癌放射敏感性中的影响，根据siRNA的设计原则，构建了序列特异性的shRNA的质粒载体，通过建立卵巢癌移植瘤模型，采用医用直线加速器源皮距照射瘤组织，观察到基因放疗组裸鼠体内移植瘤生长明显缓

18、慢;通过RTPCR、Western印迹、免疫组化检测到EGFR基因的mRNA和蛋白的表达明显抑制，证实序列特异性的EGFR shRNA能显著抑制EGFR基因的表达，使EGFR介导的细胞信号转导通路被阻断，抑制了EGFR基因的恶性生物学行为，提高了卵巢癌放疗的敏感性，证实了放疗敏感性的提高与EGFR基因的沉默相关。放疗作为目前肿瘤综合治疗的手段之一，在杀伤肿瘤细胞的同时，不可避免的会引起正常组织的损伤，因而影响了放疗的效果。肿瘤的基因放疗在增强放射治疗效应的同时减少放疗的不良反应，是肿瘤治疗学领域一种非常重要的发展趋势8,基因放疗在给人们带来鼓舞的同时还有很多问题需要进一步探讨。【参考

19、文献】  1 Yarden Y.The EGFR family and its ligands in human cancersignalling mechanisms and therapeutic opportunitiesJ.Eur J Cancer,2001;37(Suppl4):S3S8.2 Kim VN.Small RNAs：classification，biogenesis

20、 and functionJ.Mol Cells,2005;9(1):115.3 Tomari Y，Zamore PD.Perspective：machines for RNAiJ.Genes Dev,2005;19(5):51729.4 Paddison PJ，Candy AA,Bemstein E,et al.Short hairpin RNAs(shRNAs) induce sequence spec

21、ific silencing in mammalian cellsJ.Genes Dev,2002;16:94858.5 Nielsen JS，Jakobsen E，Holund B,et al.Prognostic significance of p53,Her2,and EGFR over expression in borderline and epithelial ovarian cancerJ.Int J Gynecol Cancer,2004;14(6):10867.6&