氧化低密度脂蛋白内皮受体在氧化低密度脂蛋白致内皮细胞损伤中的作用

1、    氧化低密度脂蛋白内皮受体在氧化低密度脂蛋白 致内皮细胞损伤中的作用        摘要目的：探讨血凝素样氧化低密度脂蛋白受体（LOX1）在氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）致内皮细胞损伤中的作用。方法：采用倒置相差显微镜观察细胞形态的改变；发色底物法检测内皮细胞培养液中的组织纤溶酶原激活物（t-PA）和纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1）的活性; 反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测LOX1mRNA表达水平。结果：单纯加入ox-LDL，内皮细胞出现胞体收缩，细

2、胞膜破坏等明显的损伤性改变，培养液中PAI-1活性较对照组高3倍（P0.05），LOX1 mRNA水平表达增高；而当培养液中同时加有LOX1抑制剂polyinosinic acid时，内皮细胞形态损伤不明显，培养液中PAI-1活性低约2.6倍（P0.05），同时LOX1 mRNA水平降低。结论：LOX1介导了ox-LDL对内皮细胞的损伤，可能在血管损伤性疾病的发生中起重要作用。主题词受体，LDL;内皮； 细胞; 纤溶酶原激活物，组织型;抑制素中分类号R543；Q513.5文献标识码A文章编号1000-4718(2000)10-0897-04 Role of oxidized LDL recep

3、tor in endothelial cellular injury by oxidized low-density lipoproteinXU Ya-qin（Institute for Cardiology Vascular Diseases Reaseach ,First Clinical Hospital, ）ZHANG Jun-hua（Institute for Cardiology Vascular Diseases Reaseach ,First Clinical Hospital, ）KE-Yang（Institute for Cancer Research ,School of

4、 Oncology, Beijing Medical University, Beijing 100034,China）NING Tao（Institute for Cancer Research ,School of Oncology, Beijing Medical University, Beijing 100034,China）FENG Li-ya（Institute for Cancer Research ,School of Oncology, Beijing Medical University, Beijing 100034,China）TANG Chao-shu（Instit

5、ute for Cardiology Vascular Diseases Reaseach ,First Clinical Hospital, ）AbstractAIM： To explore the role of LOX1 in endothelial cellullar injury by ox-LDL. METHODS: The morphological changes of endothelial cells were observed with inverted phasecontrast microscope; tissue plasminogen activator（t-PA

6、） and plasminogen activator inhibitor-1（PAI-1）activity were measured with chromogenix；LOX1 mRNA expression was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR). RESULTS: Incubation of ox-LDL induced endothelial cells contraction and cellular membrane rupture, increased LOX1 mRNA e

7、xpression，PAI-1 activity 3 times than control per 24 h per 105（P0.05），but had only minor effect on t-PA activity . When HUVECs were incubated with ox-LDL as well as LOX1 inhibitor, polyinosinic acid, these changes of endothelial cellullar morphology, the increase of PAI-1 activity and LOX1 mRNA expr

8、ession were attenuated. CONCLUSION: LOX1 mediated HUVECs injury by ox-LDL, suggested that the activating of LOX1 may play an important role in pathogenesis of vessel injurious diseases.MeSHReceptors, LDL; Endothelium; Cells; Alteplase; Inhibin大量证据表明由氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）诱

9、发的内皮细胞损伤是导致动脉粥样硬化、高血压等血管损伤性疾病的重要因素，但其详尽机制还不甚明了。近年研究发现不同组织细胞上存在多种ox-LDL受体，其中血凝素样ox-LDL内皮受体（lectin-like ox-LDL receptor,LOX1）是1997年Sawamura等新发现的存在于血管内皮细胞表面的ox-LDL特异受体，本工作在培养的人脐静脉内皮细胞上，观察LOX1在ox-LDL致内皮细胞损伤中的作用。材料和方法一、 材料人脐静脉内皮细胞系（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）由北京市肿瘤研究所提供，组织纤溶酶原激活物(tissu

10、e plasminogen activator,tPA）和纤溶酶原激活物抑制剂（plasminogen activator inhibitor,PAI）活性检测试剂盒购自上海荣盛公司，引物由Gibco公司合成，逆转录试剂盒、Taq酶、dNTP、RNA提取试剂盒购自Gibco公司。二、 方法(一) HUVECs系培养用含10%小牛血清的1640培养基培养，细胞汇集成单层达80%，0.01%胰酶37消化5 min，以2×105/孔接种于24孔板，培养24 h后加药。实验分组：（1）对照组； （2）ox-LDL 25 mg/L；（3）ox-LDL 50 mg/L；（4）ox-LDL 100

11、 mg/L； （5）ox-LDL 50 mg/L+polyinosinic acid（PIA）。（二）ox-LDL的制备参照文献2取健康人新鲜空腹血浆，采用二步法超速离心，分离低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL），LDL定量采用考马斯亮兰法。LDL氧化修饰采用铜离子法。LDL氧化修饰程度通过测定硫代巴比妥酸反应物质值，ox-LDL产生的丙二醛是LDL的4.3倍。(三) 内皮细胞形态观察不同组内皮细胞在相差显微镜下观察细胞单层和形态改变。（四） tPA、PAI活性测定采用发色底物法，操作按试剂盒说明进行。（五） RNA提取一步法提取细胞总RNA，经电泳鉴定未被降

12、解，SDU-68型紫外分光光度计对RNA初步定量,测定A260/A280结果一、内皮细胞形态学变化正常对照组细胞呈单层鹅卵石样排列，胞核居中呈椭圆形，核仁明显，细胞无重叠生长，ox-LDL组细胞表面出现黑色颗粒，胞内见空泡，核膜模糊，较多的细胞变圆脱落，有细胞破碎，未脱落细胞收缩变小，多有细长突起相互牵连。二、细胞培养液中tPA、PAI活性测定ox-LDL组细胞培养液中PAI活性显著高于正常对照组（P0.05），且随ox-LDL浓度提高PAI活性逐渐增加，呈浓度依赖方式，同时给予LOX1抑制剂polyinosinic acid后，PAI活性降低，与正常对照组比无显著差异，但ox-LDL对细胞培

13、养液中tPA活性无明显影响（P0.05），见表1。Control ox-LDL(mg/L)PIA+ox-LDL (50 mg/L) 2550100PAI（IU/mL）0.19±0.02 *#tPA（IU/mL）0.72±0.03 0.70±0.01 0.71±0.01      *P0.05， *P0.01 vs control； #P0.05 vs ox-LDL 50 mg/L group； PIA:polyinosinic acid. 三、LOX1mRNA水平的检测（RT-PCR）LOX1的PCR产物为193

14、bp，-actin的PCR产物为392 bp，与理论设计相符。ox-LDL组内皮细胞LOX1 mRNA表达显著高于对照组（P0.05），且在一定浓度范围内呈剂量依赖方式，加LOX1抑制剂polyinosinic acid，LOX1mRNA水平与对照组无显著差别。见1，表2。    Fig 1A Results of LOX1 gene expression obtained by RT-PCR1ALOX1 RT-PCR 扩增产物电泳谱    Fig 1B Results of -actin gene express

15、ion obtained by RT-PCR1B-actin RT-PCR扩增产物电泳谱M:Marker; C:control; P:polyinosinic acid; ox1: ox-LDL 25 mg.L-1; ox2:ox-LDL 50 mg.L-1；ox3:ox-LDL 100 mg.L-1Control ox-LDL(25-100mg/L)ox-LDL (100 mg/L+PIA)25501000.02±0.01 * * * #     * P0.01 vs control; # P0.05 vs ox-LDL 100 mg/L g

16、roup. 讨论研究表明，动脉粥样硬化中ox-LDL是导致内皮损伤的主要原因1，3，它不仅损伤内皮细胞的形态及结构，而且可降低内皮细胞的抗凝纤溶活性，损害内皮依赖的舒张功能等，但它引起内皮损伤的作用途径及机制目前尚不清楚。有研究认为ox-LDL对内皮细胞损伤主要归因于溶血卵磷脂产生的增加4，也有研究认为是ox-LDL通过干预L-精氨酸-NO途径所致5，但这都不足以完全解释ox-LDL对内皮细胞的损伤作用。体内外研究表明内皮细胞摄取代谢ox-LDL是通过一纯受体途径，而且这一受体与经典的清道夫受体不同6。Sawamura等7在1997年克隆出了ox-LDL的内皮受体即LOX1，LOX1是一膜蛋白

17、，在结构上属于C型血凝素家族，它有两个显著特征：一是主要在血管内皮细胞表达，二是能特异的与ox-LDL结合，它的这两个特征决定了其在ox-LDL对内皮细胞损伤中的重要地位。在本研究中，我们观察了不同浓度ox-LDL对内皮细胞的形态结构和tPA、PAI活性的影响，发现ox-LDL呈剂量依赖地引起内皮细胞形态结构的损伤及PAI活性升高，同时引起内皮细胞LOX1mRNA水平上调，当给予LOX1抑制剂后，抑制了ox-LDL对内皮细胞的上述损伤作用及LOX1mRNA水平的升高。内皮细胞是介于血液与管壁之间的屏障，其形态结构受损势必导致血管屏障功能的丧失，血液中单核细胞等易于沉积在内膜下，进一步形成泡沫细

18、胞促进动脉粥样硬化的形成。tPA、PAI是一对在纤溶系统中起关键性调节作用的物质，正常情况下，二者处于平衡之中，在某些病理因素作用下，PAI升高或tPA下降，使血液呈高血栓形成状态，促进缺血性心脏病的发生。内皮细胞是血液PAI的主要来源，本研究显示ox-LDL可引起内皮细胞培养液中PAI活性升高，但对tPA无明显影响，造成PAI与tPA比例失衡，损伤了内皮的抗凝纤溶功能，当应用LOX1抑制剂后抑制了上述作用，说明LOX1可能介导了ox-LDL对内皮细胞纤溶功能的损伤，对于动脉粥样硬化血栓形成具有重要作用。Noriaki等8研究发现肿瘤坏死因子（TNF）使血管内皮细胞上LOX1蛋白及mRNA水平

19、表达升高，TNF是导致动脉粥样硬化的主要炎症因子，推测炎症因子可能通过刺激LOX1表达使内皮细胞摄取ox-LDL增加，引起内皮功能障碍，进而促进动脉粥样硬化的发生。Miki等9在高血压大鼠模型上研究发现正常饮食和高盐饮食的自发性高血压大鼠及高盐饮食的盐敏感大鼠动静脉组织LOX1mRNA水平增高，提示LOX1可能参与了ox-LDL对内皮依赖舒张功能的损害，从而导致高血压发生。因此抑制LOX1受体可能是防治动脉粥样硬化、高血压等血管损伤性疾病的又一新途径，但LOX1介导内皮损伤的信号传导通路是什么，还需要进一步研究。徐雅琴（北京医科大学第一临床医院心血管病研究所）张钧华（北京医科大学第一临床医院心

20、血管病研究所）柯杨（临床肿瘤学院肿瘤所， 北京 100034）宁涛（临床肿瘤学院肿瘤所， 北京 100034）冯莉雅（临床肿瘤学院肿瘤所， 北京 100034）唐朝枢（北京医科大学第一临床医院心血管病研究所）参考文献1Chen L，Liang-B，Froose-DE,et al. Oxidized low density lipoproteins in normal and hyperlipidemic patients:Effect of lysophosphatiolylcholine composition on vacular relaxationJ. J Lipid Res,1997

21、,38(3):546-553.2张林华，刘秉文. 一次性密度梯度超速离心分离人血清脂蛋白J. 生物化学与生物物理学报,1989，21（3）:257-260.3Grafe M, Auch-Schwelk W, Hertel H,et al. Human cardiac microvascular and macrovascular endothelial cells respond differently to oxidatively modified LDLJ. Atherosclerosis, 1998,137:87-95.4王小东,周玫,陈瑗,等. 高密度脂蛋白对氧化修饰的低密度脂蛋白损伤内皮细胞的防护作用J. 中华医学杂志,1994,74(9):567-568.5Zhao B,Zhang Y,Lin B,et al. Endothelial cells injured by oxidized low density lip