注射用人脐带间充质干细胞种子库生产工艺的研究资料及验证资料

1、申请分类：新药注册分类：治疗用生物制品1类资料项目名称种子细胞生产工艺的研究资料及验证资料(5.0 X 107)资料项目编申请机构:申请机构地址:申请机构电话:申请机构主要研究者姓名:试验者姓名:试验起止日期:原始资料的保存地点：联系人姓名、电话:药品名称注射用人脐带间充质干细胞t=r.号_药品注册申请人名称:缩略词对照表P2代种子细胞培养基的选择2.5.1实验方案2.5.2 P1代细胞培养的实验结果2.5.3 P2代培养的实验结果2.6培养基筛选第三阶段2.7结果讨论冻存液的选择2.1研究背景2.2仪器设备2.3实验方案2.4培养基初步筛选的实验结果2.5培养基筛选第二阶段实验结果（P0P2

2、）10113.1实验方案123.2实验步骤123.3复苏取样123.4实验结果133.5结论13制备工艺路线的选择134.1实验方案144.1.1胶原酶消化法144.1.2组织块贴壁法154. 2实验结果16组织块贴壁法分离培养人脐带来源MSC1818185.1技术路线图5.2生产工艺描述5.3生产过程主要工艺参数215.4生产过程主要质控参数226生产工艺的验证246.1验证目的246.2验证方案246.3生产过程工艺参数验证246.4生产过程质控参数验证266.5实验结果307生产过程的无菌控制308参考文献329附件33缩略词对照表序号1缩略词全称11hUCMSCs人脐带间充质干细胞2D

3、MSO二甲亚枫3HSA人血清白蛋白4HES羟乙基淀粉5SY-M-A培养基61 SY-E-A蛋白消化胰酶71 SY- PS-A保存液新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第1页共 34 页注射用人脐带间充质干细胞P2代种子细胞生产工艺研究资料及验证资料本注册申报资料拟对注射用人脐带间充质干细胞P2代种子细胞的生产工艺和贮藏条件进行研究，优选出从脐带采集，分离，培养，冻存至P2代种子细胞的完整生产制备工艺方案，建立了一套从足月胎儿脐带分离传代培养至P2代种子细胞的标准生产工艺方案和质控方法，为注射用人脐带间充质干细胞成品提供质量可控的细胞来 源。1 P2代种子细胞本产品属于

4、同种异体间充质干细胞，原料来源于足月胎儿脐带，经过分离，培养, 接种，两次传代后得到P2代间充质干细胞，将P2代干细胞冻存在液氮中作为种子细 胞备用。冻存前产品通过检测细胞形态，计数，活率等理化指标，细胞表面抗原分析 鉴别，无菌，支原体等微生物检查，成骨成脂诱导分化潜能分析， 原癌基因和抑癌基 因检测， 端粒酶活性分析， 染色体核型检查等生物活性指标，确证为符合检定规程要 求的注射用人脐带间充质干细胞P2代种子细胞。 （具体内容参考本申报资料11） 。2培养基的选择2.1研究背景细胞培养是指模拟体内环境，使细胞在体外生长繁殖，并维持其结构和功能的一 种培养技术。常用的细胞培养体系包括细胞培养基

5、，无菌无毒环境，恒定的温湿度等 等。培养基的主要成份为氨基酸，碳水化合物，无机盐，维生素，血清，生长因子以 及其它成份。胎牛血清是干细胞体外扩增时常常采用的培养成份， 这种血清带有动物来源的抗 原，会在临床上引起很多潜在的危险，移植到人体内后可能会产生严重的过敏反应和 免疫排斥反应。其他的危险性包括病毒和细菌感染、朊病毒和未知的动物传染病1- 3。有报道采用异基因的人血清、富含血小板的血浆和人血小板裂解物来培养扩增干 细胞4-6。然而，血清因为批次之间的差异性影响体外培养细胞的可重复性。为了培养质量可控，使用安全，重复性高的人脐带间充质干细胞产品， 本项目选 择了无血清无抗生素成份的间充质干细

6、胞培养体系，避免以往使用的含人或动物血清新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第2页共 34 页培养体系，导致不同程度的异种蛋白混入而引起的排异反应， 以及抗生素残留对人体的影响。本研究拟对不同培养基进行筛选， 通过考察细胞的收获量，形态等指标，最终确定最优化的干细胞培养基体系，为临床应用提供支持。根据培养基临床应用的需要，选择了以下6种国内外市场上常见的无血清培养基（见下表9-1），作为脐带间充质干细胞的备用培养基进行考察。表9-1培养基选择方案一览表编号无血清培养基货号厂商ASY-M-ABPC-1TM培养基77232Lonza（龙沙）集团CFasGrow10150北

7、京百乐通DHL-1TM完全无血清培养基77203Lonza（龙沙）集团EUltraCHOTM培养基12-724QLonza（龙沙）集团FUltraMDCKTM培养基12-749QLonza（龙沙）集团2.2仪器设备2.3实验方案本研究拟选取3根脐带，每根脐带剥离获得华通氏胶剪碎后称重，取适量胶体分成等量六份，用上述6种培养基分别培养，根据以下不同培养阶段的结果，优选出最适宜的培养基体系。第一阶段为初步筛选阶段：对各种无血清培养基从P0代培养开始，根据P0代细胞的形态、融合度以及细胞计数结果，筛选出融合度高、形态良好、收获量大的培养基，去掉细胞融合度低的培养基。医用洁净工作台SW-CJ-2F苏州

8、净化设备有限公司离心机8420生物显微镜CX21KUBOTA（日本久保田）OLYMPUS （奥林巴斯公司）倒置相差显微镜1X71OLYMPUS （奥林巴斯公司）细胞培养箱MCO-2OAICSANYO（三洋电机有限公司）新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第3页共 34 页第二阶段：收获P0细胞分别加入相应的培养基继续进行培养至P1、P2代，考察细胞形态以及收获量等指标，优选最适宜的细胞培养基。第三阶段：根据P1、P2代的细胞形态和收获量等指标筛选出来的优选培养基, 进行干细胞特性检测（细胞表面抗原分析和分化潜能检测）。2.4培养基初步筛选的实验结果无菌条件下剥取脐带获

9、得华通氏胶， 洗涤后称重剪碎，每根脐带取适量胶体等量均分成6份，分别加入各组培养基中接种培养，培养14-17天后统一收获P0细胞。考察在不同培养体系中P0代细胞的形态，融合度，细胞计数等指标。2.4.1显微镜下（40X） P0代细胞的形态结果如下图9-1:新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第4页共 34 页脐帯3 P0国片242 P0代细胞融合度的观察结果三根脐带P0代细胞融合结果如下表9-2。表9-2 PO代细胞融合情况一览表培养基编号观察结果结论A7-8天开始有细胞贴壁生长，细胞为梭型，形态较小，P0代细胞收获时，细胞的融合度达到80%90%。继续实验B第六天已

10、有细胞贴壁生长，但是细胞形态较大，细胞呈衰老现象严重，P0代细胞收获时，细胞的融合度只有10%左右舍弃C贴壁生长的细胞分布比较均匀，细胞比较狭长，P0代细胞收获时， 细胞的融合度为80%左右。继续实验D6-7天开始有细胞贴壁生长，未见其发生严重的衰老现象，但是P0代细胞收获时，融合度比较低，为60%-70%之间继续实验E贴壁生长的细胞形态和A培养基比较相似，P0代细胞收获时， 融合度达到80%以上继续实验F15天后无细胞贴壁生长，此培养基不适用于脐带间充质组织块贴壁法。舍弃* 背;.二； 3-FQ43X八住士产 W 无亍-卜、审手厂-考 W： 迄三总门彳- n ( V -S-X,3-pO4XI

11、 I 3 3护OJOfOJOf1址;3-PO-F40X3-PO-F40X图9-1显微镜下（40X）P0代细胞形态图討；新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第5页共 34 页结论淘汰B和F培养基。A,C,D,E培养基培养的细胞继续培养。新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第6页共 34 页243P0代细胞计数结果结果见下表9-3。表9-3 P0代细胞计数结果脐带编号培养基编号ACDE13.20E+061.10E+069.25E+051.88E+0623.35E+069.30E+058.30E+051.50E+0633.65E+061.50E+0

12、69.75E+051.60E+06平均值3.40E+061.18E+069.10E+051.66E+06结论A培养基P0代细胞的收获量为最大，E次之，C和D最少。2.5培养基筛选第二阶段实验结果（P1-P2）用初步筛选阶段筛选出来的培养基A，C,D，E继续培养P0代细胞，观察每次传代培养后的细胞形态和收获量。2.5.1实验方案分别取相同数量的P0代细胞，种瓶于相同的培养瓶中，各加入等量A，C，D，E培养基培养。培养3天后收获P1代细胞，对P1代细胞形态进行拍照并计数。接种P1代细胞继续培养至P2代，继续考察各培养基，方法如前，优选最适宜的培养体系。2.5.2 P1代细胞培养的实验结果2.5.2

13、.1显微镜下（40X） P1代细胞的形态不同培养基下收获的P1代细胞形态图如下图9-2。新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第7页共 34 页图9-2显微镜下（40X） P1代细胞形态图新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第8页共 34 页2.522 P1代细胞计数三根脐带在不同培养基中收获的P1代细胞结果见下表9-4。表9-4不同培养基中收获的P1代细胞计数结果/T75脐带编号培养基ACDE16.00E+061.68E+062.45E+063.60E+0625.00E+061.82E+062.05E+063.28E+0634.70E+062

14、.35E+062.10E+062.50E+06平均值5.23E+061.95E+062.20E+063.13E+06结论A培养基收获的P1代细胞数量最多，E次之，C、D最少。2.5.3 P2代培养的实验结果2.5.3.1显微镜下（40 X） P2代细胞形态三根脐带在不同培养基中收获的P2代细胞结果如下图9-3新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第9页共 34 页图9-3显微镜下（40X） P2代细胞形态图2.532 P2代细胞计数结果结果如下表9-5。表9-5不同培养基中收获的P2代细胞计数结果/T75脐带编号培养基ACDE14.90E+061.86E+061.75E

15、+063.89E+0625.10E+061.63E+061.98E+063.76E+0635.20E+062.33E+061.57E+062.98E+06新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第10页共 34 页平均值5.07E+061.94E+061.77E+063.54E+06结论A培养基收获的P2代细胞数量最多，E次之，C，D最少。2.6培养基筛选第三阶段根据培养基筛选的第一和第二阶段的实验结果，对筛选出来较优的A培养基P2细胞进行细胞表面抗原检测（流式检测）和分化潜能分析，对A培养基培养出来的P2代细胞进行鉴定。261实验方案取A培养基培养的P2代细胞，检查细胞

16、活率，细胞表面抗原标志和成骨成脂诱导分化潜能。2.6.2实验结果2.6.2.1细胞活率和表面抗原分析结果2.6.2.2成骨成脂诱导分化检测结果染色法检测。检测结果见下图9-4。表9-6 A培养基培养下P2代细胞的检测结果脐带细胞 活率流式检测指标（%）CD90CD73CD105CD44C CD29CD45CD34CD19CD14HLA-DR脐带一97.8%10095.799.997.499.81.61.71.01.20.8脐带二96.7%99.599.999.295.199.71.31.80.91.20.6脐带三97.7%99.299.699.195.899.81.21.60.91.20.7结

17、果细胞活率均在95%以上，A培养基培养的细胞流式结果阳性指标CD73、CD90、CD105、CD44、CD29在95%以上，阴性指标CD34、CD45、CD19、CD14、HLA-DR小于2%。符合间充质干细胞的特征。A培养基培养的P2代细胞活率和表面抗原分析检查结果见下表9-6。新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第11页共 34 页通过三根脐带剥离胶体后在6种不同培养系统下培养、接种、传代的实验研究,考察不同培养体系下不同代次细胞的形态，融合度，计数等指标，结果发现:1)P0代细胞培养结果表明：B，F培养基细胞生长较差，不适合本生产工艺。2)P1代细胞：A、E的细

18、胞生长较密集，培养72小时后，融合度达到85%-95%左右；而C和D就相对长得比较稀松，融合度在70%-75%左右。四种培养基培养的细胞同时收获并分别计数，A培养基收获的细胞数最多，E次之，C和D最少。3)P2代细胞：根据计数结果，收获量最大的是A培养基。参考图9-3,D培养的细胞出现了很多亮点，已经呈现老化现象。实验表明，随着培养代次的增加，D培养体系下细胞形态逐渐老化。4)对A培养基的P2细胞进行活率，细胞表面抗原和成骨成脂诱导分化潜能检 测。实验结果表明，细胞表面抗原检测结果符合间充质干细胞特征，同时具有成骨成 脂诱导分化的潜能。综上所述，P0代、P1代、P2代细胞在A培养基下培养都能获

19、得最多的细胞收 获量和较佳的细胞形态，同时A培养基培养出来的P2代细胞也符合间充质干细胞的 标准，A培养基为优选培养基。脐带三2.7成骨分化-100X成骨对照-100X汁.I结果讨论图9-4 A培养基培养的P2代细胞成骨成脂诱导分化结果图成脂分化-400X成脂对照-400X脐带一脐带二4 4a新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第12页共 34 页2.8培养基主要成分见下表9-7。试剂中文名试剂英文名来源供应商L谷氨酸L Glutami ne非动物源in vitrogenDMEM/F12DMEM非动物源in vitrogen胰蛋白酶TRYP SIN 0.25% EDT

20、A非动物源in vitrogen人转铁蛋白Huma n HoloTra nsferri n人源R&DPBSPBS非动物源in vitrogenDME/F12培养基DME/F12非动物源hycl one羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液HEPES非动物源sigma重组人血小板源性生长因子P DGF-BB非动物源R&D成纤细胞生长因子bFGF非动物源R&D人转化生长因子TGF- pi非动物源R&D3冻存液的选择液氮冻存是细胞长期贮存的主要方法。冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有伴随造成生物性损伤的危险。为了将冻融过程中细胞的损伤降至最 低，冻存时向细胞培养基中

21、加入冻存保护剂，使溶液冰点降低，在缓慢冻结条件下, 细胞内水分透出，减少冰晶形成，从而避免细胞损伤 。通常在细胞悬液中加入的细胞保护剂为甘油或二甲基亚砜（DMSO），后者效果 更好，原因可能与其穿透细胞的能力较甘油强有关。根据文献报道，DMSO冻存剂的推荐使用浓度为5%15%。有文献报道9，5%DMSO，10%DMSO，15%DMSO三组不同浓度的冻存方案进 行比较，其中5%DMSO冻存浓度下细胞的活率最高。综上所述，DMSO是常用的干细胞冻存保护剂，我们拟选用DMSO+完全培养基作为冻存液配方，考察了脐带间充质干细胞在不同浓度DMSO下冻存液中的细胞活率，筛选出最优的DMSO浓度配方。新药治

22、疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第13页共 34 页3.1实验方案细胞冻存液中DMSO终浓度设定为3组，分别为5%、10%、15%，取同一批 新鲜制备生产的细胞，检测细胞活率，按以上3组分别冻存，冻存的细胞浓度为2X107个/ml,每组取4个平行样。置于程序降温盒中， 放入-80C冰箱中过夜，移入液氮 罐中贮存。一个月后复苏，考察样品在不同浓度DMSO冻存液下冻存前后的细胞活 率变化。仪器设备:（2）按常规方法消化处于对数生长期、汇合度达到85%左右的细胞，制备单细胞悬液，并计算细胞活率;（3）细胞悬液以300g离心10min，去上清液；将细胞沉淀用冻存终体积一半的完全

23、培养基重悬;向细胞悬液中缓缓加入冻存液，轻轻吹打混匀，细胞密度为2X107个/ml;将细胞悬液分装于冻存管内，每管1ml； 在冻存管上做好相应冻存信息的标记;将冻存管置于装有异丙醇的冻存盒中，于-80 C冰箱过夜，次日移入液氮罐。3.3复苏取样（1）从液氮中取出冻存管，立即投入恒温水浴箱的温水（40C）中轻轻晃动，直至冻存液完全溶解;（2）往冻存管中缓缓加入4C预冷0.9%氯化钠注射液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到离心管内；预冷0.9%氯化钠注射液洗涤冻存管，洗液一并移入离心管中;医用洁净工作台SW-CJ-2F苏州净化设备有限公司离心机8420KUBOTA（日本久保田）生物显微镜CX21OL

24、YMPUS （奥林巴斯公司）倒置相差显微镜1X71OLYMPUS （奥林巴斯公司）细胞培养箱MCO-2OAICSANYO（三洋电机有限公司）电热恒温水槽DK-420上海精宏实验设备有限公司3.2实验步骤（1）配制冻存液（其中DMSO为终浓度的2倍），往培养基中添加DMSO时,需沿着管壁缓缓加入，置于4C冰箱10min以上;(4)新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第14页共 34 页（3） 往上述离心管中缓缓加入约1015ml0.9%氯化钠注射液， 轻轻吹打混匀； 细 胞悬液经300g离心10min，弃上清液；（4）加入适量0.9%氯化钠注射液，充分混匀，取样计算细胞

25、活率。3.4实验结果实验结果见下表9-8。表9-8冻存液筛选活率实验结果实验组冻存前样品 细胞活率复苏后细胞活率样品1样品2样品3样品4平均值5%DMSO95.6%91.0%92.5%94.5%91.0%92.3%10%DMSO95.6%93.5%91.5%93.0%89.5%91.9%15%DMSO95.6%90.5%91.0%92.5%89.9%91.0%3.5结论从上表数据可知：5%、10%、15%三个实验组，冻存干细胞复苏后活率没有明显 差异。DMSO直接输注人体可能引起一些毒性反应，比如呕吐、心脏功能失调、过敏和急性肾衰，所以在保证冻存效果的前提下，考虑到临床用药的安全性，应尽量降低

26、DMSO的浓度。优选5%DMSO完全培养基配方的冻存液为最终的产品冻存液。4制备工艺路线的选择根据国内外有关脐带来源间充质干细胞 （MSC）的分离培养研究方法，结合本公 司实际情况，研究出一套生产可行，质量可控的注射用人脐带来源间充质干细胞的分 离、培养、传代、收获、冻存等一系列的制备工艺和质控方法，并在该工艺下对培养 出来的脐带来源MSC细胞纯度，形态，鉴别，检查以及相关生物学特性进行质量研 究，制订本产品的质量标准。根据国内外相关文献报道，我们选取目前常用的两种人脐带间充质干细胞分离培 养方法组织块贴壁法和胶原酶消化法”进行摸索，通过比较不同培养方法所获贴壁细 胞的形态学特征、细胞活率、收

27、获时间等指标，选取较优的工艺为实际生产工艺。新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第15页共 34 页4.1实验方案选取三条脐带，每条脐带剥得华通氏胶后等量均分为两份， 分别用组织块贴壁法和胶原酶消化法原代分离培养获得P0,P1代细胞。观察两种方法得到的P0, P1代细胞形态，计算每克华通氏胶收获的P0代细胞量以及培养时间，检测P1代细胞的活 率和表面抗原标记。优选最佳培养工艺。仪器设备:4.1.1胶原酶消化法4.1.1.1工艺路线4.1.1.2实验步骤（1）脐带：0.9%氯化钠注射液洗涤脐带。无菌镊子转移脐带至10cm无菌培养皿中,用0.9%氯化钠注射液冲洗23次，去

28、除血渍。剔除两条动脉，一条静脉。（2）分离华通氏胶：位于羊膜与血管之间的白色结缔组织即为华通氏胶，用长柄有齿镊将其撕下，放入无菌平皿中，加入少量0.9%氯化钠注射液，洗涤胶体，弃去上清液，胶体称重并记录。（3）组织匀浆：胶体中加入1ml完全培养基，用无菌长柄手术剪，在离心管中将组织剪成组织匀浆块。医用洁净工作台SW-CJ-2F苏州净化设备有限公司离心机8420KUBOTA（日本久保田）生物显微镜CX21OLYMPUS （奥林巴斯公司）倒置相差显微镜1X71OLYMPUS （奥林巴斯公司）细胞培养箱MCO-20AICSANYO（三洋电机有限公司）胶原酶消化法培养人脐带间充质干细胞工艺路线图图9-

29、5新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第16页共 34 页（4）胶原酶消化：按照酶与组织匀浆体积比为2:1,加入胶原酶（2mg/ml）,放置 于恒温震荡仪中消化，参数为：150rpm，37C,1h。（5）洗涤胶原酶：将酶消化后的组织匀浆按照体积比1：5加入0.9%氯化钠注射液稀释，用3ml移液管轻轻反复吹打810次，1000g/min,离心15min。（6）细胞种瓶：弃去上清液，细胞沉淀中加入培养基，吹打混匀，种瓶培养。培养 条件：二氧化碳恒温恒湿培养箱，参数：5%CO2，37C（7） 细胞培养和收获： 每3天全量换液一次，培养至910天，细胞融合度达到70%80%,

30、加入胰蛋白酶消化细胞。计算收获的P0代细胞量。（8）P1代细胞：取适量P0代细胞，按上述操作接种传代，培养后收获得到P1代细胞，检测P1代细胞的活率和细胞表面抗原分析指标。4.1.2组织块贴壁法4.1.2.1工艺路线图9-6组织块贴壁法培养人脐带间充质干细胞工艺路线图4.1.2.2实验步骤（1）脐带：无菌镊子转移脐带至10cm无菌培养皿中，用0.9%氯化钠注射液冲洗2 3次，去除血渍。剔除两条动脉，一条静脉。（2）分离华通氏胶：位于羊膜与血管之间的白色结缔组织即为华通氏胶，用长柄有齿镊将其撕下，放入无菌平皿中，加入少量0.9%氯化钠注射液，洗涤胶体，弃去上清液，胶体称重并记录。（3）组织匀浆：

31、胶体中加入1ml完全培养基，用无菌长柄手术剪，在离心管中将组织剪成组织匀浆块。（4）细胞种瓶：根据胶体重量，加入适量脐带间充质干细胞专用培养基，种瓶，放 置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中培养。新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第17页共 34 页细胞培养、换液：每5-6天全量换液一次，培养至1417天。细胞收获：细胞融合度达到70%80%,加入胰蛋白酶消化收获P0细胞。取适量P0代细胞，按上述操作接种传代，培养后收获得到P1代细胞，检测P1代细胞的活率和细胞表面抗原分析指标。4. 2实验结果两种方法得到的P0代细胞考察结果见下表9-9:表9-9不同生产工艺获得的P0代细

32、胞实验结果序号考察指标样本胶原酶消化法组织块贴壁法1P0代细胞收获量（个/克胶体）脐带样本11.15杓67.32 106脐带样本21.05 1067.40 106脐带样本30.92 1056.20 106平均值1.041066.97 1062P0代细胞培养天数（天）脐带样本19天14天脐带样本210天16天脐带样本39天17天平均值9-10天1417天3P0代细胞 生长形态脐带样本1形态良好，长梭型，胞浆透亮，胞体较小，立体感强。形态良好， 长梭型， 胞浆 透亮，胞体较小，立体感 强。脐带样本2脐带样本3两种工艺路线制备的P1代细胞活率，表面抗原分析指标如下表9-10。表9-10不同生产工艺制

33、备的P1代细胞检测结果脐带细胞 活率表面抗原分析指标CD90CD73CD105CD44： CD29CD45CD34CD19CD14HLA-DR酶消化法脐带一97.1%99.610099.795.999.61.91.81.41.20.7脐带二98.3%99.599.799.599.799.90.60.70.81.01.4(5)(6)(7)新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第18页共 34 页脐带三98.8%99.599.899.099.11001.01.11.41.00.9组织块贴壁法脐带一98.1%99.599.999.399.31001.21.11.11.11.1

34、脐带二97.5%99.699.899.399.21000.60.60.91.21.1脐带三97.8%99.599.999.097.399.81.20.41.41.20.9结论细胞活率在95%以上，细胞表面抗原分析结果阳性指标CD29都不低于95%，阴性指标CD34、CD45、CD19CD73、CD90、CD105、CD44、CD14、HLA-DR都不大于2%。以上三根脐带两种工艺比较的实验结果表明:1酶消化法获得的细胞形态为长梭型，胞浆透亮，胞体较小，立体感强。按照 每克胶体经酶消化后种瓶至收获的P0细胞约为1.04 X06个细胞。2组织块贴壁法所获得的细胞形态良好，与酶消化法一致，为长梭型，

35、胞浆透亮，胞体较小，立体感强。按照每克胶体接种至获得的P0细胞为6.97 X06个细胞左右。3两种方法比较发现，酶消化法获得P0代细胞时间为910天，而组织块贴壁法相对周期较长，为1417天。两种方法所获得的细胞生物学特性比较，未见 有明显的差异性。4目前，市售的胶原酶为溶组织梭状芽抱杆菌的发酵液中提取、纯化并精制获 得的生物制剂，往往还含有其他的酶，对细胞有不同的损伤，此外不同的厂家因其生 产工艺的差异可能导致酶活性出现较大差异，即使是同一厂家的相同工艺下生产的酶也存在着批间差异性。随着保存温度的变化、储存时间的长短、反复取用等原因均会 影响酶本身的活性，另外酶的浓度、体积、作用时间的不同也

36、会影响消化细胞的收获和活率，以上原因均可导致酶消化法生产工艺路线的重复性较差，在前期探索试验中 我们发现部分样本未能有效的分离出细胞。组织块贴壁法虽然在P0细胞周期较长，为14-17天，但其作为一种国内外公认的简便易行且成功率较高的常用P0代培养方法,外源性因素引入较少，操作相对简单，将华通氏胶剥取后称重剪碎直接种瓶，步骤较 少，可重复性高，稳定性较强，更好的保持了干细胞原始特性，在控制成本的同时，为临床实验提供了更安全有效的细胞来源，此方法可成为规模化生产间充质干细胞的 优选方法。新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第19页共 34 页5.2生产工艺描述521脐带华

37、通氏胶的剥离保存液送检进行支原体检测。0.9%氯化钠注射液冲洗脐带,75%乙醇浸没整根脐带消毒灭菌。氯化钠注射液重复洗涤去除残留乙醇。无菌手术剪将脐带剪成约23cm数段，清除脐带小段血管中淤血和凝块。剔除脐带的两条动脉，一条静脉。位于羊膜与血管之间的白色结缔组织即为华5组织块贴壁法分离培养人脐带来源MSC5.1技术路线图般区域-I i百级区:S万级区9-7P2代种子细胞生产工艺流程图从采集瓶中取出脐带,重复23次，去除血渍。；细胞检测合格，入库储存!新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第20页共 34 页通氏胶，用有齿镊将其撕下，放入无菌平皿中，加入适量0.9%氯化钠

38、注射液，洗涤胶体。522组织块制备胶体转移至50ml离心管，称量记录。用无菌组织剪将称重后的华通氏胶体剪切成14mm3的组织匀浆块，加入0.9%氯化钠注射液定容至4045ml，离心800900g,5mi n。收集末次洗涤液（至少30ml）送检无菌。5.2.3接种根据胶体重量，加入适量专用培养基SY-M-A，定容组织匀浆浓度约为0.50.6g/ml，移液器吹打匀浆均匀后，每个T75培养瓶中接种1ml组织匀浆，加入9ml专用培养基SY-M-A混合培养。5.2.4华通氏胶的P0代培养平置培养瓶使组织块尽量均匀分布于整个底面， 将培养瓶放置于二氧化碳恒温恒 湿培养箱。 培养条件：37.0 5C,二氧化

39、碳体积分数为5.0 .2%。第一次换液：组织块培养至第56天进行全量换液。将培养瓶中的未贴壁的组织块和旧的SY-M-A一起合并转移到50ml离心管，800900g，离心5min,去掉上清液，将离心后的残余组织块合并到1个50ml离心管中，加入适量新鲜SY-M-A，移液管吹打均匀，等量均分到原来的培养瓶，然后加SY-M-A定容至10ml/T75培养瓶。平置培养瓶使组织块尽量均匀分布于整个底面，放置CO2恒温恒湿培养箱继续培养。第二次换液：培养第1012天换液。稍稍倾斜培养瓶，移液管轻轻吸掉5ml旧的SY-M-A，加入10ml新鲜SY-M-A，使换液后每个培养瓶中培养液体积为 放置CO2培养箱继续

40、培养。第三次换液：培养第1415天时，如果细胞融合度未达到70%80%时，增加一次半量换液。用移液管轻轻吸掉7.5ml旧的SY-M-A，再加入等量新鲜SY-M-A，放置CO2培养箱继续培养。5.2.5 P0代细胞收获组织块培养的第1417天，细胞克隆团的面积百分比到达70%80%时，消化收获。5.2.5.1 P0代收获:去除培养基上清液，0.9%氯化钠注射液洗涤细胞。培养瓶中加入适量消化酶15ml。新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第21页共 34 页SY-E-A，直至浸润培养瓶底面。静置1min后，取培养瓶，倒置显微镜下观察，细胞 呈圆形，大部分贴壁组织块和细胞脱

41、落，终止消化（消化时间不超过5min）。细胞悬液移入离心管中，少量0.9%氯化钠注射液冲洗瓶壁，洗涤液转入离心管中，移液管吹打悬浮后静置30秒，100m无菌滤网过滤，滤液离心，300g，10min。弃去洗涤 上清液，0.9%氯化钠注射液重悬细胞定容至4045ml。吹打混匀，送样检测细胞数量和细胞活率。525.2P0代细胞传代与培养:洗涤细胞悬液，离心，300g，10min。弃去上清，用新鲜SY-M-A轻轻吹打重悬 浮细胞，按照规定的传代细胞密度接种传代。每个T175瓶接种细胞悬液，补加新鲜SY-M-A，使每个T175培养瓶中的SY-M-A的最终体积约为22ml。放置于二氧化碳 恒温恒湿培养箱开

42、始培养。条件：37.0.5C,二氧化碳体积分数为5.0.2%05.2.6细胞传代细胞培养至7224小时，倒置显微镜镜下观察细胞融合度达85%90%后，即可进行消化收获。5.2.6.1消化转移旧培养液至无菌容器中（如T175培养瓶）备用。适量0.9%氯化钠注射液轻轻冲洗培养瓶，洗涤液弃去。每个培养瓶按比例加入SY-E-A消化细胞，使之浸润培养瓶底面。静置1min后，取培养瓶，倒置显微镜下观察，细胞呈圆形，大部分细胞 脱落，终止消化（消化时间不超过5min）。收集细胞悬液，适量0.9%氯化钠注射液洗涤培养瓶，合并洗液一并转移到离心管中，离心，300g，10mi n。5.2.6.2合并后细胞计数弃去

43、洗涤上清，适量0.9%氯化钠注射液重悬细胞，合并重悬液至一个离心管中, 送样检测细胞计数和细胞活率，细胞悬液离心，300g，10min。5.2.6.3传代与培养弃去洗涤上清，用新鲜SY-M-A轻轻吹打重悬细胞，将重悬细胞液定容到一定体积后分装至50ml离心管中。根据规定的传代细胞密度接种传代，每个T175瓶接种细胞悬液，补加新鲜SY-M-A，使培养瓶中SY-M-A的最终体积为22ml。置于二氧化碳恒温恒湿培养箱开始培养。条件：37.0.5C,二氧化碳体积分数为5.0.2%05.2.7细胞的收获和冻存新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第22页共 34 页细胞培养至72

44、24小时，倒置显微镜镜下观察细胞融合度达85%90%后，即可新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第23页共 34 页并将悬液体积定容到冻存终体积的1/2，浓度为冻存终浓度的两倍，取样进行种子细胞质量检定。从4C冰箱中取出配制好的冻存液，沿管壁缓缓加入到细胞悬液中，移液管轻轻吹打均匀，使细胞密度与要求冻存密度一致。按每支冻存管1.0ml细胞悬液的标准分装。5.2.7.5程序性降温:使用程序降温仪进行程序性降温。将需冻存的细胞放置于程序性降温仪中按照标准冻存程序降至-80C以下。5.2.7.6细胞入库:冻存结束后，将冻存盒取出转移到液氮罐中贮存。5.3生产过程主要工艺参数

45、见下表9-9。进行消化收获5.2.7.1消化收获:将培养瓶内旧培养液转移至无菌容器中（如T175培养瓶）备用。0.9%氯化钠注射液洗涤细胞培养瓶，弃去洗涤液。每个培养容器按比例加入SY-E-A消化细胞，使消化液浸润培养瓶底面。静置1min后，取培养瓶至倒置显微镜下观察，细胞呈圆形,大部分细胞脱落，终止消化（消化时间不超过5min）。收集细胞悬液，0.9%氯化钠注射液洗涤培养瓶，洗涤后的细胞悬液一并转移到离心管中，离心，300g, 10mi n。5.2.7.2合并洗涤:弃去洗涤上清液，0.9%氯化钠注射液重悬细胞沉淀，细胞重悬液合并到离心管中，离心，300g，10min。5.2.7.3过滤和细胞

46、计数:弃去洗涤上清液，0.9%氯化钠注射液重悬细胞沉淀。细胞重悬液过100 ym细胞筛网，滤去絮状物或细胞团块。滤液全部移入离心管中,定容，移液管轻轻吹打均匀,送样检测细胞计数和细胞活率，滤液等量分装到离心管中,加入0.9%氯化钠注射液定容后，离心，300g，10mi n。5.2.7.4细胞的冻存分装:弃去上清液，根据计数结果，在离心管中加入适量的SY-M-A，重悬细胞沉淀,新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第24页共 34 页表9-9主要生产过程工艺参数一览表序 号工序关键控制项目控制参数1华通氏胶的分离和培养组织匀浆接种密度0.50.6g/75cm2培养基用量1

47、0ml/75cm22P0代细胞的收获传代培养收获天数培养第1417天细胞融合度70%80%消化酶用量3ml/75cm消化时间不超过5min传代密度50006000个/cm2培养基用量22ml/175cm23细胞传代（P1代）培养时间72戈4h细胞融合度85%90%消化酶用量5ml/175cm2消化时间不超过5min传代密度50006000个/cm2培养基用量22ml/175cm24细胞冻存（P2代）培养时间72i24h细胞融合度85%90%消化酶用量5ml/175cm2消化时间不超过5min过滤100 um细胞筛网滤过冻存密度1.8 1072.4 X107个/ml5.4生产过程主要质控参数见下

48、表9-10。表9-10主要生产过程质控参数一览表类 别样品质控项目质控方法标准规定频次脐 带处 理脐带样本检测脐 血 检测HIV-1/2抗体酶联免疫法阴性每份HBsAg酶联免疫法阴性每份HCVAb酶联免疫法阴性每份An ti-T P酶联免疫法阴性每份新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第25页共 34 页ALT速率法阴性每份新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第26页共 34 页脐带保存液支原体PCR法阴性每批种 子干 细胞 制备 过程 检测华通氏胶 末次洗涤 上清需氧菌及真菌全自动细菌分枝 杆菌培养监测系统检测法阴性每批厌氧菌及真菌全自动细

49、菌分枝 杆菌培养监测系统检测法阴性每批消化收集 细胞前（P0、P1代）贴壁细胞形态镜下观察呈梭形，应为 成纤维样细胞每批细胞悬液（P0、P1代）细胞活率细胞计数仪检测85%每批含细胞的 培养液（P0、P1代）无菌直接培养法不得检出每批种子干细胞冻存消化收集 细胞前贴壁细胞形态镜下观察呈梭形，应为 纤维样细胞每批细胞悬液细胞计数细胞计数仪检测标示量的90%120%每批细胞悬液细胞活率细胞计数仪检测85%每批细胞悬液无菌需氧菌 及真菌全自动细菌分枝 杆菌培养监测系统检测法阴性每批厌氧菌 及真菌全自动细菌分枝 杆菌培养监测系统检测法阴性每批细胞悬液及上清支原体培养法及DNA染色法阴性每批细胞悬液间充

50、质干细胞表面抗 原分析流式细胞术（FCM）符合规定每批细胞悬液染色体检查G显带核型分析符合规定每批细胞悬液成骨、成脂诱导 分化潜能染色法符合规定每批新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第27页共 34 页6生产工艺的验证6.1验证目的采用现有生产工艺进行三批中试规模生产，对主要工艺参数和质控参数进行验证，并选取活率、计数、细胞表面抗原分析、无菌、支原体检查、诱导分化、原癌基因及抑癌基因分析，端粒酶及核型分析等指标对制备出的脐带间充质干细胞代细胞进行检测和鉴定，以验证现有制备生产工艺的稳定性、可行性和重复性。6.2验证方案取3根合格脐带（脐带编号：12802000430

51、0, 128020000100, 128020001700）,进行3批中试生产规模制备（细胞培养规模控制在约500个T175培养瓶/批），细胞制备工艺按照5.2章节进行，对主要的工艺参数和质控参数进行验证，同时以P2代冻存前细胞为本次再验证实验的关键节点，开展活率、计数、细胞表面抗原分析、无 菌、支原体检查、诱导分化、原癌基因及抑癌基因分析，端粒酶及核型分析等检测。生产出的产品经检验合格，说明本生产工艺参数是稳定、成熟、可行和可控的。6.3生产过程工艺参数验证见下表9-11。表9-11主要生产过程工艺参数一览表工序关键控制 项目控制参数细胞批次1280200043120100012802000

52、01120100012802000171201000华通 氏胶的分 离和培养组织匀浆接种密度20.50.6g/75cm20.57 g/75cm20.52g/75cm20.59g/75cm2培养基 用量10ml/75cm210.0ml/75cm210.0ml/75cm210.0ml/75cm2P0代细胞 的收获传培养 天数1417天15天16天17天细胞 融合度70%80%70%80%80%细胞悬液原癌基因、抑癌 基因分析/i-r-4*TH-;、/.宀 曰. 实时荧光定量PCR法符合规定每批细胞悬液端粒酶活性端粒重复序列扩增法符合规定每批P2新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及

53、研究资料第28页共 34 页代消化酶 用量3ml/75cm23ml/75cm23ml/75cm23ml/75cm2消化时间不超过5min3.5min3.5min3.5min传代密度50006000个/cm25450个/cm25650个/cm25850个/cm2忌#甘 培养基用量22ml/175cm222ml/175cm222ml/175cm222ml/175cm2细胞 传代（P1代）培养时间7224h89h88h89h细胞 融合度85%90%90%90%90%消化酶 用量5ml/175cm25ml/175cm25ml/175cm25ml/175cm2消化时间不超过5min4.0min3.5mi

54、n3.5min传代密度50006000个/cm25760个/cm25890个/cm25650个/cm2忌#甘 培养基用量22ml/175cm222ml/175cm222ml/175cm222ml/175cm2细胞冻存（P2代）培养时间7224h66h65h87h细胞 融合度85%90%90%90%90%消化酶 用量5ml/175cm25ml/175cm25ml/175cm25ml/175cm2消化时间不超过5min3.5min3.5min4.0min过滤100 um筛网滤过100 um100 um100 um冻存密度1.8 X072.4 107个/ml2.3007个/ml2.3507个/ml2

55、.4007个/ml新药治疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第29页共 34 页6.4生产过程质控参数验证见下表9-12、见下表9-13、见下表9-14。表9-12注射用人脐带间充质干细胞种子细胞（12802000431201000）工艺质控参数检测结果工序样品质控项目质控方法标准规定检测结果脐 带处 理标本检测脐 血 检测HIV-1/2抗体酶联免疫法阴性符合规定HBsAg酶联免疫法阴性符合规定HCVAb酶联免疫法阴性符合规定An ti-T P酶联免疫法阴性符合规定ALT速率法阴性符合规定脐带保 存液支原体PCR法阴性符合规定种 子干 细胞 制备 过程 检测华通氏胶 末次洗

56、涤 上清需氧菌及真菌全自动细菌分枝杆菌培养监测系统检测法阴性符合规定厌氧菌及真菌全自动细菌分枝杆菌 培养监测系统检测法阴性符合规定消化收集 细胞前 （P0代）贴壁细胞形态镜下观察呈梭形，应为 成纤维样细胞符合规定细胞悬液（P0代）细胞活率细胞计数仪检测85%93.8%含细胞的 培养液（P0代）无菌直接培养法不得检出符合规定消化收集 细胞前 （P1代）贴壁细胞形态镜下观察呈梭形，应为 成纤维样细胞符合规定细胞悬液（P1代）细胞活率细胞计数仪检测85%91.5%含细胞的 培养液（P1代）无菌直接培养法不得检出符合规定种子干消化收集 细胞前贴壁细胞形态镜下观察呈梭形，应为 成纤维样细胞符合规定新药治

57、疗用生物制品 3 类9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第30页共 34 页表9-13注射用人脐带间充质干细胞种子细胞(12802000011201000)工艺质控参数检测结果工序样品质控项目质控方法标准规定检测结果脐 带处 理标本检测脐 血 检测HIV-1/2抗体酶联免疫法阴性符合规定HBsAg酶联免疫法阴性符合规定HCVAb酶联免疫法阴性符合规定An ti-T P酶联免疫法阴性符合规定ALT速率法阴性符合规定保存 液支原体PCR法阴性符合规定种子华通氏 胶末次需氧菌及真菌全自动细菌分枝杆菌 培养监测系统检测法阴性符合规定细胞悬液细胞计数细胞计数仪检测标示量的90120%2.3杓7个/1ml

58、细胞悬液细胞活率细胞计数仪检测85%93.6%细胞悬液无菌需氧菌及真菌全自动细菌分枝杆菌 培养监测系统检测法阴性符合规定厌氧菌及真菌全自动细菌分枝杆菌 培养监测系统检测法阴性符合规定细胞悬液 及上清支原体培养法及DNA染色法阴性符合规定细胞悬液间充质干细胞表面抗 原分析流式细胞术(FCM)符合规定符合规定细胞悬液染色体检查G显带核型分析符合规定符合规定细胞悬液成骨、成脂诱导 分化潜能染色法符合规定符合规定细胞悬液原癌基因、抑癌 基因分析/i-r-4*TH-;、/.宀 曰. 头时荧光定量PCR法符合规定符合规定细胞悬液端粒酶活性端粒重复序列扩增法符合规定符合规定细胞冻存新药治疗用生物制品 3 类

59、9.种子细胞的生产工艺资料及研究资料第31页共 34 页干细胞制备过洗涤上清厌氧菌及真菌全自动细菌分枝杆菌培养监测系统检测法阴性符合规定消化收集 细胞前 （P0代）贴壁细胞形态镜下观察呈梭形，应为 成纤维样细胞符合规定细胞悬液（P0代）细胞活率细胞计数仪检测85%94.3%含细胞的 培养液（P0代）尢菌直接培养法不得检出符合规定消化收集 细胞前 （P1代）贴壁细胞形态镜下观察呈梭形，应为 成纤维样细胞符合规定细胞悬液（P1代）细胞活率细胞计数仪检测85%92.5%含细胞的 培养液（P1代）尢菌直接培养法不得检出符合规定消化收集 细胞前贴壁细胞形态镜下观察呈梭形，应为 成纤维样细胞符合规定细胞悬

60、液细胞计数细胞计数仪检测标示量的90120%2.0杓7个/1ml细胞悬液细胞活率细胞计数仪检测85%92.8%细胞悬液无菌需氧菌 及真菌全自动细菌分枝杆菌培养监测系统检测法阴性符合规定厌氧菌 及真菌全自动细菌分枝杆菌 培养监测系统检测法阴性符合规定细胞悬液 及上清支原体培养法及DNA染色法阴性符合规定细胞悬液间充质干细胞表面抗 原分析流式细胞术（FCM）符合规定符合规定细胞悬液染色体检查G显带核型分析符合规定符合规定细胞悬液成骨、成脂诱导 分化潜能染色法符合规定符合规定细胞悬液原癌基因、抑癌 基因分析头时火光定量PCR法符合规定符合规定细胞悬液端粒酶活性端粒重复序列扩增法符合规定符合规定新药治疗用生物制品 3 类9.种子细