重组乙型肝炎病毒P22e基因在HepG2细胞中的表达(一)

1、重组乙型肝炎病毒P22e基因在HepG2细胞中的表达(一)    作者：刁志宏，张明霞，朱幼芙，何海棠，王战会，陈金军，侯金林【关键词】 肝炎病毒,乙型；基因重组；真核表达Construction of recombinant vector of HBVP22e gene and its expression in HepG2 cells【Abstract】 AIM: To construct the recombinant expression vector of pCDNA3.1+HBVP22e and transfect HepG2 cells f

2、or the expression of HBVP22e, and to assess its relations to HB. METHODS： HBVP22e cDNA was obtained from plasmid p3.8 which carried 1.2 copies HBV (adr subtype) genome by PCR and inserted into universal vector pMD18T for identification of its DNA sequence. The recombinant plasmids were constructed b

3、y pCDNA3.1+ and transfected into HepG2 cells via liposom. HBVP22e protein was analyzed by immunohistochemistry and microparticle enzyme immunoassay. RESULTS： Expression vectors of recombinant pCDNA3.1+HBV P22e were successfully constructed and transferred into HepG2 cells. Its expressed steadily in

4、HepG2 cells after cultured over several passages. CONCLUSION： HBVP22e can be expressed in HepG2 cells.【Keywords】 hepatitis B virus; gene recombinant; eukaryote expression【摘要】 目的： 利用pCDNA3.1+真核表达载体，建立了稳定表达乙型肝炎（HBV）P22e的HepG2细胞系，用以研究HBVP22e与乙型肝炎发病机制的关系. 方法： 以含1.2 copies HBV基因（adr亚型）p3.8II质粒为模板，PCR获得HB

5、VP22e cDNA片段，分离插入通用T载体pMD18T中鉴定，然后装入真核表达型载体pCDNA3.1+中，脂质体转染HepG2细胞株，免疫组化鉴定细胞内表达，微粒子免疫检查培养上清中分泌抗原. 结果： 成功构建了真核表达载体pCDNA3.1+ HBVP22e，并转染HepG2细胞，经多次传代培养鉴定，获得稳定表达HBVP22e的HepG2细胞系. 结论： HBVP22e可在HepG2中表达.【关键词】 肝炎病毒，乙型；基因重组；真核表达【中图号】 R373.2， R512.6， Q7680引言HBV基因组含S，C，P，X 4个基因组1, C基因除了编码的核壳蛋白HBcAg外，同时编码的前C蛋

6、白HBeAg2，是调节免疫的功能蛋白, 也是病毒高水平复制的标志，与乙型肝炎的发病机制关系最为密切. P22e是HBeAg形成过程中的中间产物，P22e可转运和插入细胞膜、释放入胞质, 也可转运入细胞核3. 长期以来对滞留的P222e在感染中的作用不明. 由此我们利用pCDNA3.1+表达载体，建立了稳定表达HBVP22e的HepG2细胞系，以供进一步研究P22e的生物学功能.1材料和方法1.1材料质粒菌株pCDNA3.1+表达载体Invitrogen公司产品由王战会博士提供. 通用T载体pMD18T为大连宝生物有限公司产品. 含1.2 copies HBV基因（adr亚型）p3.8II质粒由

7、本实验室保存提供. 工程菌株E. coli DH5由本实验室保存传代. 细胞株HepG2细胞由本实验室保存提供. 根据Genbank公布HBV基因（adr亚型）设计针对HBVP22e基因PCR引物，上游引物Primer C1: 18731891 5 GGAATTCATGTCCAAGCTGTGCCTTGGGT 3，插入EcoR I酶切位点；Pcrimer C2: 24542434 5 GCTCTAGACTAACATTGAGATTCCCGA 3，插入Xbal I酶切位点. 引物合成及克隆产品测序由大连宝生物有限公司公司完成. 主要试剂和工具酶，克隆用限制性内切酶EcoR I，Xbal I，T4 D

8、NA Ligase，胶回收纯化、质粒抽提纯化等试剂均购自大连宝生物有限公司；脂质体转染试剂为LipofectamineTM 2000，InvitrogenTM life公司产品；细胞培养用DMEM培养基与胎牛血清（FCS）为PAA产品；G418为Gbico公司产品；检测HBeAg为Abbott公司微粒子免疫荧光法AxSYM专用试剂盒；HBe Monoclonal Antibody (Mouse)为ViroStat公司产品；免疫组化试剂盒为鼎国公司产品.1.2方法以含1.2 copies HBV基因（adr亚型）p3.8II质粒为模板，以Primer C1，Primer C2为一对引物按常规方法

9、进行PCR，反应条件为: 94变性30 s，55退火40 s，72延伸40 s，共35个循环，扩增结束后72延伸5 min，电泳观察结果. PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，按pMD18T试剂盒说明要求，16， pMD18T与HBV P22ecDNA进行连接反应1 h以上，CaCl2法转化E. coli DH5菌株，经氨苄青霉素抗性及筛选阳性克隆，经EcoR I，Xbal I双酶切鉴定后送大连宝生物有限公司进行DNA序列测定. 测序结果用WDNASIS与目的序列进行对比分析. 按常规方法获得pMD18T HBV P22e质粒，EcoR I，Xbal I双酶切后回收短片段，同时用

10、相同的限制性内切酶切割载体pCDNA3.1+并回收长片段；T4 DNA ligation连接靶基因及pCDNA3.1+载体片段，CaCl2法转化E. coli DH5菌株，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，挑取20个克隆，PCR法及限制性内切酶分析鉴定，阳性克隆再送大连宝生物有限公司进行DNA序列测定. 测序结果用WDNASIS与目的序列进行对比分析. HepG2细胞使用含100 mL/L FCS的DMEM培养基及加双抗（完全DMEM培养基）在37 50 mL/L CO2条件下培养. 按常规方法获得pCDNA3.1+ HBV P22e质粒后，采用脂质体介导基因转染的方法，按说明书要求：于50 L

11、无血清DMEM细胞培养液中加入0.8 g质粒，另50 L无血清DMEM细胞培养液中加入2.0 L脂质体，轻轻混匀，室温放置15 min，加入到6孔培养板中用DMEM培养液洗过两次的单层HepG2细胞上，在37 50 mL/L CO2条件下培养8 h后，换用完全DMEM培养基37 50 mL/L CO2培养，48 h后改用终浓度400 mg/L G418的完全DMEM培筛选阳性细胞，阳性克隆再扩增培养以G418以300 mg/L维持，按常规进行传代培养；并设空载体pCDNA3.1+转染作为对照. 取培养上清用Abbott公司微粒子免疫荧光法(microparticleenzymeimmunoas

12、say, MEIA)上AxSYM检测HBeAg示HBV P22e的表达. 阳性克隆采用免疫组化观察细胞内HBV P22e的表达，免疫细胞组织化学SP法操作过程依说明书进行.2结果经PCR获得HBVP22e cDNA，重组T载体pMD18T HBV P22e及其经EcoR I，Xbal I双酶切15 g/L琼脂糖电泳结果见图1. pMD18T HBV P22e测序结果，其插入序列经用WDNASIS与目的序列进行对比分析，完全相符合. 重组表达载体pCDNA3.1+ HBV P22e及其经EcoR I，Xbal I双酶切15 g/L琼脂糖电泳结果见图2. pCDNA3.1+ HBV P22e测序结

13、果，其插入序列经用WDNASIS与目的序列进行对比分析，完全相符合. pCDNA3.1+ HBV P22e转染HepG2后，取培养上清用Abbott公司微粒子免疫荧光法上AxSYM检测HBeAg示HBV P22e的表达(图3)：pCDNA3.1+ HBV P22e转染HepG2后，阳性克隆免疫组化观察细胞内HBV P22e的表达(图4)：HepG2 cells转染 pCDNA3.1+ HBV P22e后，胞内见阳性着色. HepG2 cells转染 pCDNA3.1则无.图1PCR获得HBVP22e cDNA及应用限制性内切酶酶切方法对重组载体pMD18THBV P22 e的鉴定结果（略）图2

14、应用限制性内切酶酶切及PCR方法对重组载体pCDNA3.1+ HBV P22e的鉴定结果（略）图3HepG2转染后培养上清中HBeAg表达量A：阳性克隆细胞； B：对照组细胞.（略）图4pCDNA3.1+ HBV P22e转染HepG2后，阳性克隆观察细胞内HBV P22e的表达SABC ×400（略）3讨论人类感染HBV后，可以呈现出急性、慢性病毒性肝炎，或者仅成为带毒而不发病的亚临床状态；HBV的感染也是发生肝硬化和肝癌的常见病因，这多认为与HBV的X基因相关4. 但以往也有报道这些均与前C基因编码HBeAg的分子调控与人机体免疫应答相互作用有关，HBeAg还是病毒高水平复制的标

15、志5；HBVP22e是HBeAg形成过程中的中间产物，P22e可转运和插入细胞膜、释放入胞浆, 也可转运入细胞核，P22e可能是参与HBV复制调节的分子机制6. P22e的后一段序列(AA23-73)与Fas(接收凋亡信号的细胞表面分子)死亡区结合蛋白(FADD)的死亡效应区(DED)有23.5%的同源性，FADD对TNF敏感而诱导凋亡, 已知有与DED氨基酸同源序列的型单纯疱疹病毒E8蛋白和传染性软疣病毒MC159蛋白, 能抑制Fas抗体(一种促效抗体, agonist antibody)和TNF诱导的细胞凋亡7, HBV的P22e蛋白可能也有相同的作用,但迄今未见报告.我们利用真核表达载体

16、pCDNA3.1+，建立了在细胞内稳定表达HBVP22e的HepG2细胞系，以供进一步研究P22e的生物学功能，为下一步研究其与肝细胞凋亡关系的研究奠定了基础.【参考文献】1 骆抗先. 乙型肝炎基础与临床M. 2版. 北京：人民卫生出版社, 2001：27.2 Salffeld J, Pfaff E, Noah M, et al. Antigenic determinants and functional domains in core antigen and e antigen from hepatitis B virus J. J Virol, 1989,63(2):798-808.3 骆

17、抗先. 乙型肝炎基础与临床M. 2版. 北京：人民卫生出版社, 2001：49.4 郭双平, 王文亮, 翟宇强. HBV X基因真核表达载体的构建及对肝癌细胞恶性表型的影响J. 第四军医大学学报，2001，22(13)：1161-1165.5 Zhang YY, Summers J. Enrichment of a precoreminus mutant of duck hepatitis B virus in experimental mixed infectionsJ. J Virol, 1999, 73(5):3616-3622.6 Scaglioni PP, Melegari M, Wands JR， et al. Posttranscriptional regulation of hepatitis B virus