应用逆转录多重PCR方法检测正常核型急性白血病患者的易位相关融合基因(1)

1、    应用逆转录多重PCR方法检测正常核型急性白血病患者的易位相关融合基因(1)    】 为了探讨逆转录多重PCR方法在检测具有正常核型的急性白血病（AL）患者的易位相关融合基因中的价值，应用包括19种染色体易位特异性引物对的逆转录多重PCR方法对37例经常规细胞遗传学方法揭示为正常核型的AL患者进行了检测。结果表明： 有8例（21.6%）AL患者分别检测出有PML/RARA、AML1/ETO、CBF/MYH11和BCR/ABL等4种融合基因的存在。 结论：逆转录多重PCR可在核型正常的AL患者中检出隐匿的染色

2、体易位，故凡常规细胞遗传学显示为核型正常的AL患者，均应对其进行逆转录多重PCR检测。 【关键词】 急性白血病Detection of Fusion Genes Associated with Specific Translocations in Acute Leukemia Patients with Normal Karyotypes by Using Multiplex RT-PCRAbstract    This study was aimed to explore the usefulness of multiplex reverse tran

3、scription-polymerase chain reaction（multiplex RT-PCR）in detection of fusion genes associated with specific translocations in acute leukemia (AL) patients with normal karyotypes.37 AL patients with normal karyotypes were analyzed by multiplex RT-PCR.The results showed that 4 types of fusion genes suc

4、h as PML/RARA，AML1/ETO，CBF/MYH11，BCR/ABL were detected in 8 (21.6%) patients by multiplex RT-PCR.In conclusion，multiplex RT-PCR is useful in detection of fusion genes associated with specific translocations in acute leukemia (AL) with normal karyotypes and it would refine the karyotype analysis. Whe

5、n the normal karyotypes were detected in acute leukemia patients by conventional cytogenetic method，the multiplex RT-PCR should be performed for them.Key words    Multiplex RT-PCR; Acute leukemia; Normal karyotype研究表明，细胞遗传学和分子遗传学在急性白血病（AL）的诊断分型，判断预后和指导治疗中占有重地位，但是仍有一些AL患者经常规核型分析未能

6、检出异常染色体改变，例如正常核型检出率在B-细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T-细胞ALL(T-ALL)和急性髓细胞白血病(AML)中分别达到10%-25%、30%-40% 和40%-47% 1-3。这是由于常规细胞遗传学对小于1条带的微小染色体改变不敏感的缘故。近年来，国内外已有若干报道应用逆转录多重PCR技术（multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction） 可以筛选具有隐匿性染色体易位的AL患者。为了评估所谓正常核型的AL患者中隐匿性染色体易位的频率和逆转录多重PCR检测隐匿性染色体易位的价值，我们应用逆转录多重P

7、CR对一组37例常规细胞遗传学证实为核型正常的AL患者进行了研究。材料和方法病例选择2004年3月至2004年10月来苏州大学第一附属医院就诊的急性白血病患者共37例，其中男19例，女18例，年龄11-80岁，中位年龄43.6岁。所有病例均经骨髓细胞形态学、组织化学染色和免疫表型确诊，分别为M1 9例，M2 7例，M3 5例，M4 3例，M5 9例，M6 1例，T-ALL 2例，混合性急性白血病（B淋系，髓系）1例。所有病例在初诊时均做了染色体核型分析，同时抽取患者骨髓1-5 ml，肝素抗凝后置-80冰箱保存，备做逆转录多重PCR。常规细胞遗传学方法采用骨髓短期培养法，按常规制备染色体。应用R

8、显带方法进行核型分析，核型异常按人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN）19954加以描述。每例至少分析20个中期细胞。逆转录多重PCR方法主试剂与仪器 RNA提取试剂TRIZOL reagent 购自美国Gibco/BRL公司。Moloney鼠白血病病毒逆转录酶、RNasin、Taq DNA聚合酶购自美国Amersham Pharmacia Biotech公司。PCR引物由上海生工生物工程方法服务有限公司合成。PCR扩增仪为美国Perkin-Elmer公司产品。RNA提取 TRIZOL Reagent产品说明书进行。逆转录反应 按MMLV逆转录酶产品说明，采用6-随机引物将RNA逆转录为cDN

9、A。多重巢式聚合酶链反应（multiplex nested PCR） 设立8组平行PCR反应，分别使用1-8组多重PCR引物，引物参照文献5。采用广泛表达的转录因子增强子结合因子基因（E2A）mRNA作为阳性内对照。每组检测的融合基因包括：    组： inv(16)(p13q22)的CBF/MYH11；t(6;11)(q27;q23) 的MLL/AF6；t(11;19)q23;p13.1) 的MLL/ELL    组： t(1;11)(p32;q23) 的MLL/AF1p；t(10;11)(p12;q23) 的

10、MLL/AF10 ； dupMLL(11q23) 的MLL(11q23)    组： t(1;19)(q23;p13) 的E2A/PBX1；t(12;21)(p13;q22) 的TEL/AML1    组： t(3;21)(q26;q22) 的AML1/MDS1；t(8;21)(q22;q22)AML1/ETO；t(16;21)(p11;q22) 的TLS/ERG    组： t(1;11)(q21;q23) 的 MLL/AF1q ；t(4;11)(q21;q23) 的MLL

11、/AF4；t(9;11)(p22;q23) 的MLL/AF9；t(11;19)(q23;p13.3) 的MLL/ENL    组： t(9;22)(q34;q11) 的BCR/ABL    组： t(6;9)(p23;q34) 的DEK/CAN    组： t(11;17)(q23;q21) 的PLZF/RARA；t(15;17)(q21;q22) 的PML/RARA    巢式第1轮PCR： 25 l体系中，含有10×缓冲液

12、2.2 l，25 mmol/L MgCl2 1.32 l，10 mmol/L dNTP 0.4 l。 第1-8组第1轮多重PCR引物 5 pmol/band共2.5 l，cDNA 2.5 l，Taq DNA聚合酶1.25 U。PCR条件为：95 5分钟，95变性30秒，58退火30秒，72延伸1分钟。共25个循环，产物置4保存。    巢式第2轮PCR： 25 l体系中，含有10×缓冲液2.4 l，25 mmol/L MgCl2 1.44 l，10 mmol/L dNTP 0.48 l。第1-8组第2轮多重PCR引物6.25 pmol /ban

13、d共2.5 l，第1轮产物 2.5 l，Taq DNA 聚合酶1.25 U。PCR条件为：95 5分钟，95变性30秒，58退火30秒，72延伸1分钟。共25个循环，然后72延伸10分钟，产物置4保存。        分离PCR：每组PCR中均包括数对引物，因此，可能出现的染色体结构畸变数目亦有数种，且这些畸变的阳性扩增条带的大小可能很接近。为此，设立分离PCR以分辨某一条带究竟代表哪种染色体结构畸变，即对出现阳性条带的多重PCR组，按所含引物对数设立2-5个PCR，使用第2轮多重PCR引物（10 pmol）扩增一

14、种畸变的一对引物，PCR反应条件与第2轮PCR相同。            作者：马力，薛永权，潘金兰，何军，吴亚芳，岑建农，温丙昭【摘】为了探讨逆转录多重PCR方法在检测具有正常核型的         本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。电泳和扫描

15、 采用1.5 g/L琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后阳性扩增条带用凝胶电泳分析系统分析。结 果染色体核型分析37例均为正常核型。男性为46，XY，女性为46，XX。逆转录多重PCR检测经2轮巢式PCR反应，例1-4、例5、例6-7、例8分别出现R8、R4、R1 和R6阳性条带（图A），后经分离PCR检测分别存在R8C，R4A，R1A和R6A阳性条带（图B）。因此证实在37例AL患者中，8例（21.6%）分别被检出存在PML/RARA，AML1/ETO，CBF/MYH11和BCR/ABL等4种融合基因异常，其中例1-5初诊相同均为M3，但染色体核型分析却是正常核型，未发现M3最常见的t(15;17)异

16、常。而经逆转录多重PCR检测发现例1-4具有PML/RARA融合基因，但例5却具有AML1/ETO融合基因。例6-7诊断为M4EO，染色体核型分析显示为正常核型，而逆转录多重PCR检测显示具有CBF/MYH11融合基因。例8诊断为M2，常规核型分析也是正常，但逆转录多重PCR检测显示具有BCR / ABL (e1a2)融合基因。其余29例经逆转录多重PCR检测结果均为阴性，未检测出易位相关融合基因。37例患者的一般情况及实验结果见附表。Table. Karytype analysis and multiplex PT-PCR results of 37 patients with acute

17、leukemia（略）讨 论近年来，应用RT-PCR方法检测AL融合基因的报道日益增多，因其具有较高的灵敏度和特异度，为科研及临床广泛应用。但是该方法一次只能检测出一种融合基因，逆转录多重PCR一次能检测多种融合基因，由于扩大了基因检测覆盖面，因而提高了隐匿性染色体易位的检出率，受到临床和研究人员的青睐。但是，针对具有正常核型的AL患者逆转录多重PCR检测，国内目前还未见报道。    我们应用逆转录多重PCR方法对37例经常规核型分析未检出染色体异常的AL患者进行检测，发现8例（21.6%）存在特异性染色体易位相关的融合基因异常，其中例1-4具有PML/

18、RARA基因，例6-7具有CBF/MYH11基因，例5经形态学，组织化学染色及免疫分型诊断为M3，经亚砷酸治疗效果差，1个疗程治疗后患者未能缓解，后经逆转录多重PCR检测发现存在AML1/ETO基因，从而纠正了最初的诊断。另外1例AL患者诊断为M2，经2个疗程化疗患者未能缓解，确诊4个月后死亡。该患者虽然核型正常，但经逆转录多重PCR检测，发现存在BCR/ABL（e1a2）基因，即属于PhAL，其所以预后不良也就得到了解释。    国内外大量研究认为，存在特异性染色体改变或融合基因如t(8;21)或 AML1/ ETO，t(15;17) 或PML/RAR

19、A，inv(16)或 CBF/MYH11的AL患者预后较好，而具有正常核型的AL患者预后中等。实际上具有正常核型的AL患者在遗传学上也是不均一的：有的在基因水平上存在着特异性染色体易位，有的存在着基因突变，例如Flt3突变，C-kit突变，AML1突变等6-8。真正不伴有基因改变的正常核型患者只占其中的一部分。因此，应用逆转录多重PCR对其进行检测以便将它们进一步细分为不同预后的类型而给予相应的治疗，是十分必的。    逆转录多重PCR方法可以快速有效的检测AL的基因改变，为核型分析提供了重补充。本研究显示，PML/RARA和CBF/MYH11是本组正常

20、核型AML患者中检出最多的融合基因。这说明t(15;17)和inv(16)是两种很容易为常规核型分析漏检的易位，可能由于inv(16)是一种微小的染色体异常，而M3的分裂相质量通常较差，染色体短小，带纹不清的缘故。由于逆转录多重PCR能在正常核型患者中检出隐匿性染色体易位，因此我们认为，对初诊时具有正常核型的AL患者均应进行逆转录多重PCR检测。鉴于本研究中主发现PML/RARA，AML1/ETO，CBF/MYH11和BCR/ABL这4种融合基因，特别是前3种为AML中最多见的与好的预后相关的易位，而后1种为成人ALL最多见的与不良预后相关的易位，因此我们认为，用逆转录多重PCR检测时只需检测

21、这4种融合基因，以达到提高效率和减少成本的目的。    当然，应用逆转录多重PCR方法也有其局限性。因其目前一次最多只能检测29种融合基因，检测结果阳性固然可以帮助诊断，检测结果阴性也不能完全排除存在其他基因异常，包括基因突变的可能性。【参考文献】1Preiss BS，Kerndrup GB，Schmidt KG，et al.Cytogenetic findings in adult de novo acute myeloid leukaemia.A population-based study of 303/337 patients.Br J Haemetol，2003;123:219-2342薛永权，过宇，吴亚芳等.1058例急性非淋巴细胞白血病的细胞遗传学分析.中华医学遗传学杂志，2001;18: 247-2503Rowley JD，Reshmi S，Carlson K，et al.Spectral karyotype analysis of T-cell acute leukemia.Blood，1999