探讨HMGB1对肝星状细胞细胞外基质合成的影响

1、探讨HMGB1对肝星状细胞细胞外基质合成的影响         你正在浏览的临床医学论文是探讨HMGB1对肝星状细胞细胞外基质合成的影响                    摘要： 目的：探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对肝星状细胞(hepatic stellate cell HSC)合成细胞外基质(extrac

2、ellular matrix ECM)的影响。方法：剂量效应组分别用含HMGB1 0 mg/L,0.1 mg/L,1.0 mg/L,10 mg/L，20 mg/L和40 mg/L的HMGB1培养液培养HSC-T6 6 h;时间效应组以含有10 mg/L HMGB1的培养液培养0 h、6 h、12 h、18 h和24 h,对照组以不含HMGB1的培养液分别培养HSC-T6细胞，留取各组培养液离心后的上清，用双抗体夹心ELISA方法检测其上清中PP和C的含量。结果：对照组HSC-T6细胞ECM分泌量较低;HSC-T6的ECM分泌量与HMGB1呈剂量依赖关系(r=0.835,0.955，P<0

3、.05);10 mg/L HMGB1时间效应组的PP,C分泌量在18 h和24 h 均明显高于对照组(P<0.05)。结论：HMGB1能诱导HSC-T6细胞分泌ECM，可能在肝纤维化的发生、发展中发挥重要作用。        关键词： HMGB1;HSC-T6;细胞外基质;肝纤维化        目前认为，HSC的激活是肝纤维化发生发展的关键环节1，HSC激活的始动因素是肝损伤和炎症反应，而HSC激活的过程包括早期启动激活和后期“

4、持久化”激活，激活的“持久化”是维持HSC激活状态及产生ECM的必要条件。多种急性肝损伤因素虽能引发早期启动激活，但因为缺乏“持久化”激活因素，所以不会导致肝纤维化或肝硬化的发生(如HAV/HBV引起的急性肝炎)，而各种慢性感染或慢性炎症反应能持续激活HSC (如        HCV/HBV引起的慢性肝炎)，因此，慢性炎症反应的持续存在是HSC激活“持久化”的基础。近年来，随着对炎症反应认识的深入，人们发现了一种有效的炎症介质HMGB1,它具有较其他细胞因子释放晚和作用时间长的特点2。那么HMGB1是否对肝纤维化

5、的发生、发展发挥重要作用呢?我们课题组的先前研究表明在肝纤维大鼠的肝组织中HMGB1的表达明显增强，但HMGB1是否通过激活HSC参与肝纤维化的发生发展目前尚不清楚，本研究拟通过HMGB1刺激HSC以观察ECM的合成情况来进一步探讨HMGB1与肝纤维化的关系。        1 材料与方法        1.1 主要试剂        HMGB1由本室制备保

6、存;新生胎牛血清(FCS)为杭州四季青生物工程材料研究所产品;高糖型DMEM购自英国Gibco公司;大鼠PP ，C双抗体夹心ELISA检测试剂盒购自上海晶天生物科技有限公司(进口分装);HSC-T6细胞株由北京地坛医院肝病研究所惠赠。        1.2 实验分组及处理        大鼠HSC-T6细胞系在含10%的胎牛血清的DMEM培养基中培养传代4次至对数生长期,调整细胞数为2×105密度接种于6孔培养板中,每孔1 m

7、L,细胞贴壁后改用2%的胎牛血清的DMEM培养液同步饥饿培养2 h,使培养细胞处于G0期后做下面实验：        1.2.1. HMGB1的剂量效应组：分别用含有0 mg/L、0.1 mg/L、1.0 mg/L、10 mg/L 、20 mg/L和40 mg/L的HMGB1培养液培养HSC-T6，6 h后,收集HMGB1刺激孔及对照孔培养上清液，用双抗体夹心ELISA法测HSC-T6培养上清液中PP，C的含量。以上每组均设3个复孔，具体操作严格按照试剂盒说明进行。    &

8、#160;   1.2.2. HMGB1的时间效应组：刺激组(10 mg/L HMGB1)和正常对照组(等量的PBS)分别用含10 mg/L HMGB1和等量的PBS的DMEM培养液培养HSC-T6细胞0 h、6 h、12 h、18 h和24 h,同上收集培养上清液 用双抗体夹心ELISA 方法测HSC-T6培养上清液中PP ，C的含量。以上每组均设3个复孔，具体操作严格按照试剂盒说明进行。        1.3 统计学方法     &

9、#160;  采用SPSS12.0统计软件，进行Spearman相关分析，单因素ANOVA(方差分析)，两样本比较采用LSD-t检验，实验数据均以(x±s)表示,P<0.05判定有显著性差异。        2 结果        2.1. HMGB1对 HSC-T6分泌PP、C的剂量效应        HMGB1能促进H

10、SC-T6分泌PP、C，在一定浓度范围内(0.1 mg/L10mg/L)呈剂量依赖关系(r=0.835，0.955，P<0.05)，当HMGB1浓度为10 mg/L时，HMGB1显著促进HSC-T6分泌PP、C并达峰值，当HMGB1浓度为20 mg/L时，HSC-T6 PP、C的分泌量与10 mg/L时相当，HMGB1浓度为40 mg/L时分泌量下降。(见表1)表1 不同剂量的HMGB1对HSC分泌ECM的影响        2.2. HMGB1对HSC-T6分泌PP,C的时间效应  &#

11、160;     刺激组HSC-T6分泌PP、C在0 h24 h间呈递增趋势,随着时间的延长增加,呈时间依赖关系(r=0.970，0.982，P<0.05)，正常对照组上清液PP、C含量变化趋势与HMGB1刺激组一致。在6 h和12 h两组上清液PP、C的含量无显著差异(P>0.05)，但在18 h、24 h刺激组上清液PP,C含量明显高于正常对照组(P<0.05)(见图1,图2)。        3 讨论   

12、60;    目前认为HSC在肝纤维化的进程中起重要的作用,在慢性损伤因素的持续作用下,肝脏内大量的细胞因子分泌，其中最主要的有TGF-、PDGF等3，可以使静止的HSC活化、增殖，产生大量的细胞外基质(ECM)沉积于肝组织,由于其在肝纤维化中的特殊性地位。因此，体外培养HSC常作为肝硬化基础及实验治疗研究的重要手段411 。一般认为，原代培养的HSC适用于研究相对静止的HSC生物学行为,而传代培养的HSC适用于研究活化的HSC生物学行为,本实验研究HSC的激活机制适宜选择静止状态的HSC，但原代HSC仅占肝脏非实质细胞数的5%10%，不管采用何种分离技

13、术，最终得率很低。此外，原代培养的HSC细胞不甚稳定，细胞分离状况及培养条件对实验结果的影响较大，为克服上述缺陷，目前逐渐倾向以HSC系代替原代HSC作为研究的靶细胞，并已建立若干HSC系。本研究采用的HSC-T6细胞系是由大鼠肝星状细胞经过SV40病毒转染后形成的永生细胞系,具有无限传代的特性，是肝纤维化研究的良好模型。ECM过度沉积是肝纤维化形成中关键的一步，ECM主要包括:(1)胶原:型,型, 型、型。(2)蛋白多糖:硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸等。(3)糖蛋白:层粘连蛋白、纤维连接蛋白、副层粘连蛋白、副纤维连接蛋白、粗纤维调节素。纤维化的肝脏含6倍于正常肝脏的胶原，其中,和型胶原的

14、含量显著增高。因此，检测ECM成分的含量常作为肝纤维化的辅助诊断手段1213，目前认为PP，C,层粘连蛋白及透明质酸是最具代表性的肝纤维化血清学指标，因此在实验中我们采用体外培养的HSC作为研究的靶细胞,用ELISA方法检测培养细胞上清液中PP，C的含量。本实验所用的HSC是经过传代培养的活化细胞有一定水平的ECM表达，因此通过在此基础上采用HMGB1作用于HSC作为刺激组，并设立相应的对照组观察ECM量的变化来说明问题。我们研究证实随着HMGB1浓度的增加其促进HSC分泌ECM能力也相应增加，正常培养的HSC-T6细胞ECM分泌量较低,而经HMGB1刺激后HSC能分泌大量的PP,C。在0.1

15、 mg/L10 mg/L范围内, HMGB1诱导HSC-T6分泌PP,C的量与HMGB1的浓度呈显著的剂量依赖性关系;HSC-T6 ECM的分泌与时间关系显示：HMGB1刺激组与无HMGB1刺激的对照组HSC-T6分泌ECM的量在0 h24 h之间呈时间依赖性关系。但对照组与刺激组相比,各相应时间点ECM的分泌量低于刺激组，在18 h、24 h两个时间点有显著差异。上述研究结果进一步表明，即使传代培养的HSC作为具有活化生物学行为细胞，但在体外失去HMGB1刺激后，其分泌ECM的作用也逐渐减低。因此，HMGB1在肝纤维化的发生发展过程中可能发挥重要作用。   &#

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