一氧化氮及其合酶在杀伤肿瘤细胞中的作用(一)

1、一氧化氮及其合酶在杀伤肿瘤细胞中的作用(一)关键词：巨噬细胞肺泡一氧化氮合酶肿瘤活化的巨噬细胞(M)在抗肿瘤过程中具有十分重要的意义。一氧化氮 (NO)作为活化的 M 的细胞毒效应分子之一，在杀伤肿瘤效应中起重要作用 1。本研究通过测定肺 M 内诱导型一氧化氮合酶（ iNOS）及其产物 NO 水平，并应用特异性NOS抑制剂来观察肺 M 对肿瘤细胞杀伤作用的影响， 旨在探讨肺 MNOS 活性与肿瘤杀伤力之间的关系，以阐明肺 M 在抗肿瘤免疫中的地位。1 材料和方法1.1 肺 M 的制备及培养体质量2025g 的纯种 C57雄性小鼠 32 只，购自上海西普尔 -必凯实验动物有限公司,随机分成实验组

2、和对照组， 每组16 只，均经腹腔注入 2%戊巴比妥钠麻醉 ,腹主动脉放血处死 ,暴露颈部气管后 ,用 37生理盐水进行支气管肺泡灌洗 ,每次 1ml,共 15 次。将回收的灌洗液以1500r/min 离心 10min,弃上清 ,用含 10%小牛血清的最低必需培养液 (MEM)配成 1×106个/ml 的细胞悬液。将细胞悬液接种于96孔板中 ,37,5%CO2培养 2h,洗去未贴壁细胞 ,根据需要分别加入不同剂量(50，100，150，200U/ml)的干扰素 （INF）,继续培养 24h。1.2 肿瘤细胞培养上清液的收集将无菌取得的肥大细胞肿瘤细胞P815(上海肿瘤研究所提供 )以

3、 5× 105个/ml 的密度培养在 RPMI1640 培养液中 ,置 37,5%CO2培养箱培养 48h,2500r/min 离心 20min,取上清液 , 置-20保存待用。1.3iNOS活性测定用 Smith 薄层层析法2测定上清液培养标本中瓜氨酸(citrulline) 的生成量，以此反映 iNOS的活性。1.4NO 测定 10mmol/L 硼酸钠溶液系列稀释10mmol/L 亚硝酸钠，测定其相应于波长为545nm 时的光密度 (D)值,作曲线 ,并得出直线回归方程式 3。取上清培养液，加入等量的Greiss 试剂（ 1%磺胺、 0.1%萘乙二胺、 2.5%磷酸 ),室温放置

4、 10min，545nm 比色，根据直线回归方程计算出 NO 含量。1.5 肺 M 肿瘤杀伤活性测定在培养板内加入肺M 悬液 100孔l/，实验组再加入 2mmol/LNG 单甲基左旋精氨酸（L-NMMA，Sigma公司），50l/孔，置 37， 5%CO2培养箱培养4h，再加入含 10%P815上清液的营养液 100l/孔，置 37,5 CO2 培养 72h 。 每孔加二甲基亚砜(DMSO)100混l,匀静置 20min,在 PG-3022酶联仪上用 570nm 波长测定D 值,计算肿瘤细胞生长抑制率。1.6 统计学处理所有数据采用X±s表示，组间显著性检验用配对资料t检验，各指标

5、进行直线相关分析。2 结果2.1 不同剂量 INF 对肺 M 产生 NO 的影响不同剂量的INF 与活化的肺M 共同培养 24h 后,培养液中 NO 含量随着 INF 剂量的增加而升高 (图1),且呈明显的剂量依赖关系(r=0.985,t=19.89,P0.01)。图 1INF对肺巨噬细胞 NO 产生和 iNOS活性的影响fig1TheeffectofINF onNOproductionandactivityofiNOSbymacrophages :NO; :iNOS2.2INF 对肺 MNOS活性的影响不同剂量 INF 作用于肺 M 后，肺 MiNOS 活性随 INF剂量的增加而升高（图 1

6、）,与 INF的剂量有明显的相关性(r=0.990,t=19.78，P0.01)。2.3L-NMMA 对肺 M 肿瘤杀伤活性的影响活化的肺M 与 P815单独作用时，其培养上清液中 NO 的浓度为 (18.47 ±5.00) mol/L，而预先加入 L-NMMA 再培养的上清液中 NO 浓度为 (11.07 ± 4.06) ，mol/L两组之间有显著性差异 (P0.05)；未加 L-NMMA 组肺 M 对 P815 细胞生长的抑制率为 66.6%，预先加入 L-NMMA 组为 43.3%，较前者明显降低两组D(570)值分别为 0.132 ± 0.032和 0.2

7、92 ± 0.065，P0.05。3 讨论NO 由 L-精氨酸经 NOS作用而生成。 NOS 主要有两种同工酶：结构型(constitutive,cNOS)和诱导型（ inducible,iNOS)。M 、库普弗细胞是iNOS的主要表达细胞，因此从肺M 内测得的为iNOS4。某些细胞因子，如 INF、TNF、IL-2等可诱导 iNOS的活性，增加 NO 的合成 5。活化的 M 具有杀伤肿瘤细胞的能力 ,其作用机制是多样的 ,可能是通过细胞间的联接或是依赖于一种或多种细胞毒效应分子， 包括 IL-2、过氧化氢、 TNF等。自 1985 年发现活化的 M 可产生 NO 以来 6，随着有关

8、 NO 研究的深入，越来越多的结果表明 NO 与活化 M 杀伤肿瘤细胞的作用密切相关。 Hibbs 等7首先发现在缺乏精氨酸的培养条件下，活化的 M 的细胞毒效应作用不能表达，由此推测精氨酸的分解代谢产物 NO 是活化的 M 的细胞毒效应分子。以后的研究证实了NO 具有抑制细胞生长和细胞毒性作用。 本研究发现，活化的肺 M 可以产生 NO，并对肿瘤细胞P815 有杀伤作用；在加入作为NOS 的竞争性抑制剂的L-NMMA 后，NOS代谢产物 NO 减少，对 P815的杀伤作用也相应减弱，从而也证实了由iNOS催化产生的 NO 是活化的肺 M 杀伤肿瘤细胞的一个重要的效应分子。NO 介导杀伤肿瘤细胞的机制可能是其与铁硫键（Fe-S）基团作用，形成铁 -亚硝基复合物，从而引起顺乌头酸酶 (aconitase)和线粒体呼吸链上的复合物与复合物中的Fe-S辅基的纯化与降解，从而引起细胞毒性 8。肿瘤细胞内铁的大量丧失，破坏了许多代谢酶的活性，因此可阻断肿瘤靶细胞的能量代谢和DNA 复制。同时活化的M 产生的 NO