锐基HPV试剂盒操作流程及注意事项资料

1、锐基HPV试剂盒操作流程及注意事项一、 试剂组成成分1 DNA萃取试剂（4保存）：（1）A：DTAB Solution B：CTAB Solution C：Dissolving Solution 2 扩增反应组试剂（-20保存）：A：Pre-Mix B：HPV positive control(105 copies/l) C：Yeast tRNA D：IQzyme DNA Polymerase E：6X Loading Dye F：DNA Marker二、 模板制备1 不同组织的取样：A：虾苗检体（1）取约 30只的检体。（PL期之前的虾苗约需50只左右，PL前期 ( PL12) 约需30只；

2、进入PL12 30期的幼虾（体长1 cm以上）仅取头部即可。）（2）将其放入含600l DTAB Solution的1.5 ml 离心管中。（3）用研磨棒将虾眼磨碎至溶液呈雾状。B：肝胰腺（1）取约20 mg的样品，放入含 600l DTAB Solution的1.5 ml 离心管中。（2）用研磨棒将其磨至呈雾状。C：种虾粪便（1）取长约1cm的样品，放入含600l DTAB Solution的1.5ml 离心管中。（2）用研磨棒将其磨至雾状。注意：离心管要提前在管盖和管壁上用记号笔做好标记，整齐放置于离心管架上；先用眼科剪剪取一定组织，再用牙签小心挑取所需要的量，放于对应的离心管中。切忌取太

3、多，否则影响DNA萃取质量；每取一个样品均需更换完剪刀、手套、保鲜袋和牙签后，再进行下一个样的取样；研磨时需小心，别将裂解液溅出，最好每研磨好一个离心管后更换一副手套。2 DNA萃取步骤（1）将完成取样步骤的样品置于75金属浴中，5分钟后取出置于室温下。（可提前打开金属浴让其升温至所需温度）（2）冷却后稍微振荡，加入700l 氯仿，振荡并充分混合20秒以上，再以12000 g离心5分钟。（3）取上层液加入含100l CTAB与900 l ddH2O的全新2 ml 离心管中，振荡器混合均匀后，置于75金属浴5分钟。（注意：取上层液时，必须非常小心，不可吸到接口处的白色物质，大约能取400l。另可

4、少取，都不要碰，否则会使下一步溶液变得混浊。在上一步离心时，可往新离心管中加入相应所需溶液。）（4）取出置于室温下，冷却后以12000 g离心10分钟。（5）小心倒去上层液，加入150 l 的 Dissolving Solution，置于 75金属浴5分钟，然后冷却至室温。（6）以12000 g离心5分钟，以去除不能溶解的杂质，并将澄清的溶液吸入另一全新并含有300 l 95% 酒精的离心管中。（在上一步冷却时，可往新离心管中加酒精。）（7）振荡混合均匀之后，以12000 g离心5分钟，使DNA沉淀下来，之后将酒精小心倒去。（8）加入200l 70% 酒精，振荡之后，以12000 g离心3分钟

5、。之后倒去酒精进行风干。风干程度为不见水珠为止，时间灵活撑握。（风干时，可配PCR反应液。）（9） 溶解DNA沉淀。如果样品取的是鳃，就加400l ddH2O；如果是其它组织，就加200l ddH2O。三、PCR扩增1 阳性对照的制备：用2对18的比例配制。即先取2l 105 HPV的阳性样品，再取18l的灭菌水，振荡器混合均匀后，以4000g离心20s，此操作重复两次。依此方法，配制104、103、102的阳性样品。（注意小心操作，以免发生污染。操作熟练后，可不配102 阳性样品。）2 反应液配制：反应液：Pre-Mix reagent 12.5 l IQzyme DNA Polymeras

6、e 0.5 l（1）按此比例算出样品与阴、阳性对照所需的各种试剂的总体积，然后将各总体积相加，再乘以1.1倍，即是所要配的总体积。（2）先加Pre-Mix reagent，再加IQzyme DNA Polymerase，且每种试剂的量一定要加足够。配好后再在振荡器上混合均匀，放于4冰箱待用。（注意：拿出的试剂要放在冰盒上让其完全解冻，振荡离心两次后再加，加完各种试剂后，要马上将试剂放回冰箱。操作熟练后，可不配102 阳性样品。）3 对PCR反应管做好相应标记，先往每管中加反应液13l，再加2l模板或对照，阳性对照最后加。加完后将PCR反应管盖子盖好，再在微量振荡器上振荡约5s，放入PCR仪进行

7、PCR扩增。扩增程序为： 94 20s 55 20s循环35次 72 30s 72 30s 20 30s四、 配制1%的胶进行电泳1 称取0.4g琼脂糖放于锥形瓶中，再量取40ml的0.5TBE溶液混合，放于微波炉中煮沸，至溶液清彻透明为止，大约需1分40秒。2 冷却到60时（放于掌心，能感觉到汤但又能忍受。）加2l核酸染料，摇匀。3 组装好制胶器，并调至水平。将胶倒于制胶器中，插好梳子。待40分钟胶冷却凝固后，就可放于倒好电泳缓冲液的电泳槽中进行点样。4 取5-10l样品溶液，加1-2l 6loading Dye，混合均匀后进行点样。每排点样孔要点一个5l的Marker。5 点完后，调电泳仪

8、各参数进行电泳：U：80V；A；200A；T：40min。五、结果判定1 下图为各种不同浓度的标准品，以及实际检体的实验结果。 1 2 3 4 5 6 7 MLane 1: WSSV标准品1, 20000 copies/reaction Lane 2: WSSV标准品2, 2000 copies/reaction Lane 3: WSSV标准品3, 200 copies/reaction Lane 4: HPV的阴性对照Lane 5: 中度感染HPV的样品Lane 6: 轻度感染HPV的样品Lane 7: HPV阴性样品Lane M: 分子量标记, 848 bp, 630 bp, 333 bp2 阴性的虾类检体会在730 bp处形成唯一的亮带，此亮带为内控制组的PCR产物。3 判读步骤：（1）在339 bp或339 bp 与553 bp处同时形成亮带：阳性（2）在