成果细胞工程cell engineering

1、325第三篇动物细胞培养与组织工程What is Cell Culture?326´ Cell culture refers to the removal of cells from an animal or plant and their subsequent growth in a favorable artificial environment.´ 指离体、模拟体内生理环境，在无菌、适合温度和营养条件下，使离体细胞或组织正常生长、分 裂，并保持原有的特性。327´ The cells may be removed from the tissue direct

2、ly and disaggregated by enzymatic or mechanical means before cultivation, or they may be derived from a cell line or cell strain that has already been established.´ 细胞培养的目的既可以收获细胞本身，也可以收获细胞产物。Applications and Advantageof Cell Culture328´Cell culture is one of the major tools used in cellul

3、ar and molecular biology, providing excellent model systems for studying the normal physiology and biochemistry of cells (e.g., metabolic studies, aging), the effects of drugs and toxic compounds on the cells, and mutagenesis and carcinogenesis.It is also used in drug screening and development, and

4、large scale manufacturing of biological compounds (e.g., vaccines, therapeutic proteins).The major advantage of using cell culture for any of these applications is the consistency and reproducibility of results that can be obtained from using a batch of clonal cells.´´Applications of Cell

5、Culture329´细胞生物学基础理论的研究：细胞生长、 分裂（周期）、分化、突变、衰老、死亡等免疫学：单克隆抗体技术肿瘤生物学细胞工程和基因工程新药开发´´´´Advantage of Cell Culture330´ 1.直接在显微镜下观察活细胞的形态结构和生命活动。Advantage of Cell Culture331´ 2.研究细胞的分化和发育：Advantage of Cell Culture332´ 3.便于使用各种技术：免疫荧光、免疫组化、电镜、同位素标记等方法观察和研究细胞状况。Advantag

6、e of Cell Culture333´ 4.是分子生物学和基因工程学的研究对象。Advantage of Cell Culture334´ 5.易于施用物理、化学方法开展实验研究。´ 6.易于提供大量生物性状相似的实验对象,耗资少比较经济。´ 7.成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。Disadvantage of Cell Culture335´ 细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，但是在利用培养细胞做实验时，不应视为体内细胞 完全相同，轻易做出与体内等同的结论。动物细胞工程常用技术336´ 动物

7、细胞原代培养´ 核移植´ 动物细胞融合´ 单克隆抗体技术´ iPS诱导´ 干细胞定向分化动物细胞工程应用337´ eg 皮肤烧伤如果创面比较小（小于一元硬币），只要保持清洁，大部分人都可以自愈。如果下层真皮受损面积较大，常常需要植皮（健康 皮肤）。自体植皮是永久性的，取自他人或动物的植皮是暂时性，只在创面愈合过程中保护创面采取的措施，10-14 天后被身体排斥。因此，大面积烧伤病人，皮肤来源的问题。338动物细胞工程应用339´ eg 骨折动物细胞工程应用340动物细胞工程应用341动物细胞工程应用342动物细胞工程应用34

8、3动物细胞培养的基本过程344´ 动物组织细胞间隙中含有大量的弹性纤维等蛋白质， 将细胞通过网络的形式联系起来，形成具有一定弹性 和韧性的组织、器官。´ 从动物组织分离细胞通常采用 机械切割 + 复合酶345动物胚胎或者幼龄动物的组织、器官单细胞悬液原代培养10代细胞遗传物质未改变传代培养50代细胞遗传物质已改变无限传代细胞Explant cultureDissociated cell cultureOrganotypic cultureOrgan culturethe organ culture is able to accurately model functions

9、of an organ in various states and conditions by the use of the actual in vitro organ itself.350351352Several cells adhered to the biomaterial in the spherical state (CS) and flattened (CF) on the surface of the biomaterial, is also possible to appreciate the bone lacuna indicates as (Lac) at three d

10、ay of culture on the bovine matrix353Interaction between two cells adhered and flattened on the bovine matrix (C1, cell 1; and C2, cell 2).354355356ØIn this procedure, cells of the trophectoderm are destroyed by brief exposure to antibodies directed against human cells in tandem with complement

11、 activity.Therefore, protocol works best with high-quality embryos with an intact trophectoderm, as only the structural integrity of the blastocyst prevents the ICM from also being susceptible to the immunological reaction.ØRabbit anti-human red blood cell primary antibody357Organotypic culture

12、 -目前的hot topicCornell Bioengineers 3D Print Replacement Ears基本概念和术语360´ Primary culture ：refers to the stage of the culture after the cells are isolated from the tissue and proliferated under the appropriate conditions until they occupy all of the available substrate.原代培养：动物组织消化后的初次培养；直接取生物体细胞、

13、组织等开始的培养361362´成纤维样细胞（Fibroblast-like cells）：与成纤维细胞在形态上和外观上相似的细胞。这类细胞往往尖形和细长形，核/质低 ´上皮细胞样细胞或上皮样细胞（Ep 在形态上和外观上相似的细胞。接elial-like cells）：与上皮细胞紧密，间质少，核/质高 ´淋巴母细胞样细胞（Lymphoblast-like cells）：呈球形，通常悬浮生长，不贴附在基质表面´神经元细胞（Neuronal cells）基本概念和术语363´ Subculture ：when cells reach confluen

14、ce, thecells have to be subcultured (passaged) bytransferring them to a new vessel with fresh growth medium to provide more room for continued growth.传代培养：原代培养的细胞由于接触抑制不再分裂，需要重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继 续培养，让细胞继续增殖，这种培养叫传代培养； 将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶´ Passage number ：细胞传代培养的次数364细胞学说（Cell theory）：´ 生物体是

15、由1个或者多个细胞组成（1838, Scheiden & Sehwann）´ 细胞是生物形态结构和功能的基本单位（1838, Scheiden & Sehwann）´ 机体的病理是基于细胞的损伤（1885, Rudolf Vichow）365´ 细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上， 称为细胞贴壁。´ 细胞的接触抑制：当贴壁细胞生长到表面相互接触时， 细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑 制。366´ 接触抑制（Contact inhibition）：正常细胞生长相互接触后， 其运动和分裂活动都要停顿下来，生长

16、受到抑制，表现为细胞贴壁生长汇合成单层后即停止生长。癌细胞则不同，可堆积成立体细胞群。367368369Brdu/DAPI´ BrdU能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子，通过检测BrdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。370371´ 人工器官：暂时或永久性代替身体某些器官主要功能的“人工装置”。´ 动物克隆：通过核移植过程进行无性繁殖的技术。发育早期的动物胚胎细显微手术移植到去掉或成年动物的体细胞，经过核的卵细胞之后，在适当的条件下，可以重新发育成正常胚胎。´ 组织工程（tissue engineering）：应用工程学和生命

17、科学的原理来研究开发生物替代物，用于恢复、维持或者改进组织的学功能。372´ 奢侈基因(luxury gene):是指不同类型细胞中特异性表达的基因，其产物赋予各种类型细胞特异的形态结构特征与功能。与各种分化细胞的特殊性状有直接关系的基因。Ø 一类是在特别细胞类型中大量(通常)表达并编码特殊功能产物的基因。Ø 另一类是指导合成组织特异性蛋白的基因，对分化有重要影响，即组织特异性(tissue-specific gene)表达的基因，如表皮的角蛋白基因、肌肉细胞的肌动蛋白基因和肌球蛋白基因、红细胞的血红蛋白基因等。373´ 管家基因（house-keepi

18、ng genes），是指所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞 基本生命活动所必需的。如微管蛋白基因、糖酵 解酶系基因与核糖体蛋白基因等。具有相同遗传 信息的同一个体细胞间其所利用的基因并不相同，管家基因正是细胞动是维持细基本代谢所必须的，这的基础。化物发374´ 基因的差次表达(gene differential expression):在胚胎发育和分化过程中相继出现各种不同的细胞类型是由于有关的奢侈基因按一定的顺序相继活化的结果，这种现象称基因的差次表达(基因的顺序表成另外一种分化状态。从一种分化状态变´ 细胞分化(celldifferentiation):是

19、指从受精育过程中细胞之间在形态、结构、学特征方面产生稳定性差异的卵开生理个体能和生过程。375´ 细胞决定(cell determination):细胞在发生可识别的形态变化之前就已受到约束而向着特定方向分化，这时细胞的内部已发生变化，确定了未来发育命运，此后，分化的方向一般不会中途改变。´ 干细胞(stem cell):机体的许多组织中保留有一部分未分化的细胞，一旦需要，这些细胞便可按发育途径先进行细胞分裂，然后分化产生分化细胞。机体中这些未分化的细胞就称为干细胞。376´ Cell strain：通过选择法或克隆法培养，从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或

20、标志的细胞群。其 特性或标志必须在整个培养过程中始终存在。´ If a subpopulation of a cell line is positively selected from the culture by cloning or some other method, this cell line becomes a cell strain. A cell strain often acquires additional genetic changes subsequent to the initiation of the parent line.What is the dif

21、ference between "Cell line" and "Cell strain?"377´ When cells are isolated from a tissue to form a primary culture, assuming that the cells proliferate in vitro, a confluent monolayer or a dense cell suspension is formed. According to the traditional definition, the first ha

22、rvesting and subculture of this cell population results in the formation of a cell line Freshney, R.I. (1987). Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique. (New York, Alan R. Liss, Inc.).´ This type of cell line has a finite lifespan, during which cells with the highest growth capacity

23、 will predominate, resulting in a degree of genotypic and phenotypic uniformity in the population.378What is the difference between "Cell line" and "Cell strain?"´ A cell strain is a subpopulation of a cell line that has been positively selected from the culture, by cloning

24、or some other method.´ A cell strain will often have undergone additional genetic changes since the initiation of the parent line.´ Individual cell strains may, for example, have become more or less tumorigenic than the established line, or they may be designated as a separate strain follo

25、wing transfection procedures.379´静止培养（Static culture）：细胞培养时容器处于静止状态´转瓶培养（Roller bottle culture）：细胞培养时容器处于不停的旋转中´悬浮培养（Suspend culture）：细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖的培养方式380´ 培养条件（Culture condition）：各种细胞的培养条件相差很大，但是细胞培养的人工环 境必须包含合适的容器、培养基质，为细胞 提供必要的营养物质（氨基酸、碳水化合物、 维生素、矿物质）、生长因子、激素和气体（O2，CO2）

26、，合适的物理化学环境（PH、渗透压、温度）。381´ 合成培养基（Chemically defined medium）：各种成分的化学结构均明确的培养物的营养液´ 天然培养基也称复合培养基，是含有化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物。382´ 天然培养基主要取自动物体液或从动物组织分离提取。其优点是营养成分丰富，培养效果良好， 缺点是成分复杂，来源受限。Eg：生物性液体（如血清）；组织浸液（如胚胎浸液）；凝固剂（如血浆）等。´ 天然培养基的优点是含有丰富的营养物质及各种细胞生长因子、激素类物质，渗透压、pH等也与体内环境相似，缺点是其为成分不明确

27、的混合物， 受其来源及法规等问题的限制，制作过程复杂， 批次间差异大，并逐渐被合成培养基所取代。实 际工作中往往将天然培养基与人工合成培养基结 合使用。合成培养基383´最低限度培养基（Minimal medium）：大多数细胞能生长的最简单的培养基´条件培养基（Conditional mem）：经预先培养处理过的培养基，其中含有细胞自己合成的而对细胞生长有益的物质´选择性培养基（Selective medium）：能容许特定的细胞（如杂种细胞）存活和繁殖，但杀死其它细胞（如亲本培养基。如HAT培养基细胞选择性培养基 HAT384´1964年Little

28、field首先发明了 HAT（H-Hypoxanthine 次黄嘌呤，A-Aminopterin 甲氨喋呤，T-Thymidine 胸腺嘧啶核苷）培养基的选择培养。´细胞内DNA合成具有起始合成途径（denovo-pathway）和 中间合成途径（salvage-pathway）。中间合成途径：通过HGPRT (次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶) 的催化作用把次黄嘌呤转化成次黄嘌呤核苷磷酸(IMP)，通过TK的催化把胸腺嘧啶核苷转化成脱氧胸腺嘧 啶核苷磷酸(dTMP)，再进一步合成核酸。由于氨基蝶呤可阻碍起始合成途径，所以培养基中含有它时，细胞便只有中间合成途径，所以必须供给核苷酸。至

29、于缺失中间合成途径的细胞，可失去增殖能力臻于死亡。´´HGPRT的严重遗传缺陷所致。此种疾病是一种性连锁遗传缺陷，见于男性。386´ Cell line :原代培养经传代后获得的一群（通常不均一的）细胞After the first subculture, the primary culture becomes known as a cell line or subclone.Cell lines derived from primary cultures have a limited life span (they are finite), and as the

30、y are passaged, cells with the highest growth capacity predominate, resulting in a degree of genotypic and phenotypic uniformity in the population.Finite vs Continuous Cell Line387´ Normal cells usually divide only a limited number of times before losing their ability to proliferate, which is a

31、 genetically determined event known as senescence; these cell lines are known as finite.Finite vs Continuous Cell Line388´ However, some cell lines become immortal through a process called transformation, which can occur spontaneously or can be chemically or virally induced. When a finite cell

32、line undergoes transformation and acquires the ability to divide indefinitely, it becomes a continuous cell line.389´ 原代培养的细胞一般传5-10代，细胞生长就会停止，大部分细胞出现衰老死亡，少数细胞能存活 到20-30代，甚至50代。´ 这一些少数群体的细胞在经历多次传代之后，又会出现生长停滞的状态，只有极个别的细胞由于 遗传物质出现改变，具备癌细胞的部分特征，使 其在体外培养条件下可以无限制的传代，通常情 况下接触抑制也消失。Continuous Cel

33、l Line :原代细胞转化390´EB病毒能在上皮细胞和B淋巴细胞中增殖，可使其转化，能长期传代。´EB病毒是Epstein和Barr于1964年首次成功地将 Burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株， 并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒，认 为该病毒是多种恶性肿瘤（如鼻咽癌）的病因之一， 它主要感染人类口咽部的上皮细胞和B淋巴细胞。´Mouse cells readily immortalize whereas human cells do NOT. This is due to telomerase.391Infection of B

34、cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid cell lines (LCL) in vitro.392B95-8(ATCC® CRL-1612)cellsthis monkey （cotton-top tamarin monkey） cellline sheds the Epstein-Barr virus that is used in transformi

35、ng B lymphocytes美国模式培养物集存库(American type culture collection)世界上最大的生物资源中心，成立于1925年细胞株（3000多种）；菌株（15000多种）；动植物病毒株（2500多种）以及重组物质等393The presence of CD23hiCD58+ cells observed as early as three days post-infection indicates a successful outcome.动物细胞培养的要求394´ 体外培养的特点´ 大部分的动物细胞要貼附在物体表面上生长，动物细胞培养

36、对营养要求比较苛刻，除了氨基酸、维生素、 盐离子、葡萄糖外，还需要添加动物血清、甚至其他 生长因子、激素等。´ 对环境适应性差，对环境敏感（PH、溶解氧、温度、剪切力等）动物细胞培养的要求395´ 培养工具´ 培养皿、培养瓶、多孔板等。动物细胞培养的要求396´ TC Treated´ 早年的细胞培养器皿都是玻璃制作的，由于玻璃表面是亲水的，不经过特殊处理，普通的细胞就可以黏附 生长。´ 现在的培养器皿通常是聚苯乙烯塑料 制作的一次性使用，透光性好，具有较好的强度和易塑性，没有毒性（CD盒的材料一样）。但是聚苯乙烯塑料表面是 疏水的，

37、所以要通过特殊处理，变成亲水的后才适用于贴壁细胞培养。动物细胞培养的要求397´ 细胞培养的边际效应´ 细胞培养孔板中，通常我们会发现孔中的细胞会聚集在孔的外侧，尤其96孔板。´ 解决方案： 对于温度不敏感的细胞，可以在接种后放置室温1-2小时，随后转移到正常37度培养箱。动物细胞培养的要求398´ 经验之谈´ 十字交叉摇匀，´ 8字摇匀，´ 十字交叉配合顺时针动物细胞培养的要求399´ 恒定的温度´ 维持动物胞旺盛生长，必须有恒定的适宜的温度´ 人胞培养的标准温度 36.5 +/- 0.5 ，

38、一旦偏离这个温度范围，细胞的正常代谢就会受到影响、甚至死亡。´ 培养细胞对于低温的耐受力比高温强。动物细胞培养的要求400´ 温度不超过39度，细胞代谢和温度正相关´ 人体细胞在39-40度 一小时，即能受到相当损伤，但仍可能恢复´ 在40-41度一小时，细胞普遍受到损伤，部分细胞无法恢复功能´ 41-42度一小时，严重损伤，大部分细胞无法恢复´ 43度一小时，细胞全部死亡´ 低温下会使细胞代谢速率降低动物细胞培养的要求401´ PH ： 7.2-7.4´ 当PH低于6或者高于7.6时，人体细胞的生长受到

39、影响、甚至死亡´ 通常会在培养基加入酚红，用于检测PH变化红色橙色黄色紫色7.47.06.57.8动物细胞培养的要求402´ 气体 ： O2， CO2´ 气体供给是人体细胞培养生存的必需条件之一´ 氧气量和合´ 开放培养三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能细胞生长所需要的各种成分。般把细胞置于95%空气加5% CO2混合气体环境特殊培养条件Hypoxia403Hypoxiachamber404动物细胞培养的要求405´ 营养 ： 培养基´ 在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行代谢所需要的各种营养，如包括十几

40、种非必 需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐等。´ 天然培养基成分：组织液、胚胎浸出液、血清 （牛、马 等等）等（部分天然培养基中的未知成分尚无法用已知化学成 分替代）动物细胞培养的要求406´ 血清 是天然培养基中最常用的培养基成分。含有许多维持细胞生长、扩增、和保持细胞生物学性状不可 缺少的未知成分。´ 最普遍的血清是 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清。其中含有多种促进细胞生长的因子、促进貼附的因子及其他活性物质。动物细胞培养的要求407´ 胎牛血清： 八月龄胎牛´ 新生牛血清： 出生14小时内、未哺乳´ 小牛血清：出生10个月以内

41、血清中长因子的成分主要是蛋白质、氨基酸、葡萄糖、生素等。蛋白质主要是白蛋白和球蛋白。激素：EGF、FGF、MSA、IGF等其他细胞培养相关试剂409´ 平衡盐溶液:Hanks, PBS´ PH调整液:NaHCO3, HEPEs´ 细胞消化液： 胰蛋白酶、EDTA、胶原酶´ 抗生素： 青霉素 100U/ml, 链霉素 100ug/ml动物细胞培养的要求410´ 无菌的环境当细胞在体外培养，与体内相比失去了对微生物和有毒有害物质的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。所以必须保持细胞生存环境无微生物的污染、代谢物及时清等，这是维持细胞生存的基本条件。动物细胞培养的要求411´ 细胞培养设施动物细胞培养对环境的要求较高，必须保证无微生物污染和不受其他有害因素的影响。细胞培养室