第三章生物催化剂酶

1、第三章生物催化剂酶酶的神奇世界：早在酶的神奇世界：早在5000多年前，人类就已经用多年前，人类就已经用微生物进行焙烤和酿造。酶是高效的生物催化剂，微生物进行焙烤和酿造。酶是高效的生物催化剂，它们在活细胞中驱动化学反应，使机体完成生长、它们在活细胞中驱动化学反应，使机体完成生长、繁殖及代谢等生理过程。每个酶每秒钟可以完成繁殖及代谢等生理过程。每个酶每秒钟可以完成数以万计的催化反应过程，生命不息战斗不止。数以万计的催化反应过程，生命不息战斗不止。为什么有的人喝酒脸易变红而有的人脸会变白呢？为什么有的人喝酒脸易变红而有的人脸会变白呢？到底哪一种人酒量大些呢？到底哪一种人酒量大些呢？哪一种人喝酒又最伤

2、身体呢？哪一种人喝酒又最伤身体呢？ 酶与您的生活：我们生活中离不开酶。酶已经酶与您的生活：我们生活中离不开酶。酶已经在洗涤剂、纺织、酿造、皮革、造纸、医药等在洗涤剂、纺织、酿造、皮革、造纸、医药等方面得到了成功的应用，为提高生产效率、改方面得到了成功的应用，为提高生产效率、改善产品性能、确保人类可持续发展做出应有的善产品性能、确保人类可持续发展做出应有的贡献贡献。 3.1 酶的命名、分类及组成酶的命名、分类及组成3.2 酶的结构及催化特点酶的结构及催化特点3.3 酶的催化机制酶的催化机制 3.4 酶的分离纯化及活力测定酶的分离纯化及活力测定 3.5 酶催化动力学酶催化动力学3.6 酶工程的新进

3、展酶工程的新进展3.7 酶的应用酶的应用GoGoGoGoGo定义：定义：酶（酶（Enzyme）是由活细胞分泌的、）是由活细胞分泌的、具有生物催化功能的生物大分子。按它的具有生物催化功能的生物大分子。按它的化学本质可分为蛋白质类酶（化学本质可分为蛋白质类酶（P-酶）和核酸酶）和核酸类酶（类酶（Ribozyme，R-酶）。酶）。l 什么是酶？什么是酶？原始核酶的三维结构原始核酶的三维结构 3.1.1 酶的概念酶的概念3.1 酶的命名、分类及组成酶的命名、分类及组成n 酶催化的生物化学反应，称为酶促反应酶催化的生物化学反应，称为酶促反应(Enzymatic reaction ) 。n 在酶的催化下发

4、生化学变化的物质，称为在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物底物(substrate )。l根据酶所作用的底物来命名根据酶所作用的底物来命名RibonucleaseProteasel根据所催化的反应来命名根据所催化的反应来命名DehydrogenasePhosphotransferaseAminotransferasel上述两个原则结合上述两个原则结合l上述原则再加上酶的来源上述原则再加上酶的来源如牛胰核糖核酸酶如牛胰核糖核酸酶3.1.2 酶的分类与命名酶的分类与命名3.1.2.1 蛋白类酶的分类蛋白类酶的分类（一）一） 国际系统分类法国际系统分类法（二）（二） 系统命名分类法系统命名分类法

5、 氧化还原酶类氧化还原酶类 Oxidoreductases转移酶类转移酶类 Transgerases水解酶类水解酶类Hydrolases裂合酶类裂合酶类Lyases异构酶类异构酶类Isomerases合成酶类合成酶类Synthetases Synthases1961年国际酶学委员会（年国际酶学委员会（Enzyme Committee, EC）根）根据酶所催化的反应类型和机理，把据酶所催化的反应类型和机理，把P酶分成酶分成6大类：大类：l氧化氧化-还原酶催化氧化还原酶催化氧化-还原反应。还原反应。l主要包括脱氢酶主要包括脱氢酶(Dehydrogenase)和氧化酶和氧化酶 (Oxidase)。l

6、如乳酸如乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。(1) 氧化还原酶氧化还原酶 OxidoreductaseCH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOOHONADH钙和钒离子对钒溴过氧化物酶催化钙和钒离子对钒溴过氧化物酶催化H H2 2O O2 2氧化环己氧化环己烯反应的影响烯反应的影响环氧环己烷环氧环己烷 丙酮酸丙酮酸 一种化学性质比较活泼的精细化工原料一种化学性质比较活泼的精细化工原料, ,可在农药、医药、涂料等十余可在农药、医药、涂料等十余个行业得到广泛应用个行业得到广泛应用, ,如农药（杀螨剂）、增塑剂、阻燃剂、环氧树脂固化如农药（杀螨剂）、增塑剂、

7、阻燃剂、环氧树脂固化剂与稀释剂、胶粘剂、涂料等方面剂与稀释剂、胶粘剂、涂料等方面具有良好的综合利用前景具有良好的综合利用前景。l转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。的基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如：例如： 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。(2) 转移酶转移酶 TransferaseCH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH2CH3CCOOHO谷氨酸谷氨酸草酰乙酸草酰乙酸丙氨酸丙氨酸 - -酮戊二酸酮戊二酸l水解酶催化底物的加水

8、分解反应。水解酶催化底物的加水分解反应。l主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。l例如：脂肪酶例如：脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：催化的脂的水解反应：(3) 水解酶水解酶 hydrolaseH2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OH支链淀粉酶支链淀粉酶 淀粉葡萄糖苷酶淀粉葡萄糖苷酶 l裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。形成双键的反应及其逆反应。l主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。l例如：延胡索酸水合酶催化的反应。例如：延胡索酸

9、水合酶催化的反应。(4) 裂合酶裂合酶 LyaseHOOCCH=CHCOOHH2OHOOCCH2CHCOOHOH延胡索酸延胡索酸苹果酸苹果酸 柠檬酸循环，线粒体的衬质柠檬酸循环，线粒体的衬质l异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。物分子内基团或原子的重排过程。例如：例如：6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。(5) 异构酶异构酶 IsomeraseOCH2OHOHOHOHOHOCH2OHCH2OHOHOHOH6 6个亚类：异构酶、消旋酶、变位酶、顺反异构酶等个亚类：异构酶、消旋酶、变位酶、顺反异构酶等

10、6-6-磷酸磷酸- -葡萄糖葡萄糖6-6-磷酸磷酸- -果糖果糖糖酵解糖酵解右旋右旋 左旋左旋 l合成酶，又称为连接酶，能够催化合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与键的形成反应。这类反应必须与 ATP分解反应相互偶联。分解反应相互偶联。lA + B + ATP + H-O-H =A B + ADP +Pi l例如：丙酮酸羧化酶催化的反应。例如：丙酮酸羧化酶催化的反应。 丙酮酸丙酮酸 + CO2 草酰乙酸草酰乙酸(6) 合成酶合成酶 Ligase or Synthetase糖异生糖异生lATP: Creatine Phosphotra

11、nsferase ATP: 肌酸磷酰基转移酶肌酸磷酰基转移酶lGlutamate: Pyruvate aminotransferase 谷氨酸：谷氨酸： 丙酮酸丙酮酸 (GPT) 氨基转移酶氨基转移酶l单体酶单体酶 Monomeric enzymesl寡聚酶寡聚酶 Oligomericenzymesl多酶体系多酶体系 Multienzyme systems酶的命名有两种方法：系统名酶的命名有两种方法：系统名、惯用名惯用名。1. 系统名系统名：包括所有底物的名称和反应类型。乳酸乳酸 + NAD+丙酮酸丙酮酸 + NADH + H+乳酸：乳酸：NAD+氧化还原酶氧化还原酶2. 惯用名：惯用名：只取

12、一个较重要的底物名称和反应类型。乳酸：乳酸：NAD+氧化还原酶氧化还原酶乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型，如应类型，如淀粉酶、蛋白酶等。淀粉酶、蛋白酶等。(三三) 酶的命名酶的命名 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27第第1大类，氧化还原酶大类，氧化还原酶第第1亚类，氧化基团亚类，氧化基团CHOH第第1亚亚类，亚亚类，H受体为受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号该酶在亚亚类中的流水编号l自自1982年以来，被发现的核酸类酶越来越多，年以来，被发现的核酸类酶越来越多，对它的研究越来越广泛和深入。但是对于

13、分类对它的研究越来越广泛和深入。但是对于分类和命名还没有统一的原则和规定。和命名还没有统一的原则和规定。l根据酶催化反应的类型，可以将根据酶催化反应的类型，可以将R酶分为剪切酶分为剪切酶，剪接酶，和多功能酶等三类。酶，剪接酶，和多功能酶等三类。l根据根据R酶的结构特点不同，可分为锤头型酶的结构特点不同，可分为锤头型R酶，酶，发夹型发夹型R酶，含酶，含I型型IVS 的的R酶，含酶，含II型型 IVS 的的R酶等。酶等。l根据酶催化的底物是其本身根据酶催化的底物是其本身RNA分子还是其它分子还是其它分子，可以将分子，可以将R酶分为分子内催化（酶分为分子内催化（in cis，也，也称为自我催化）和分

14、子间催化（称为自我催化）和分子间催化（in trans）两）两类。类。 简单酶简单酶 酶酶结合酶结合酶辅酶辅酶 Coenzyme 辅因子辅因子辅基辅基 Prosthetic group (Table 1)HoloenzymeApoenzyme（Cofactor）3.1.3 酶的组成酶的组成 酶酶简单酶（单纯酶）简单酶（单纯酶）结合酶结合酶（全酶）（全酶）= = 酶蛋白酶蛋白 + + 辅因子辅因子辅因子辅因子辅酶辅酶 与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。辅基辅基 与酶蛋白结合得紧密的小分子有机物。与酶蛋白结合得紧密的小分子有机物。金属激活剂金属激活剂 金属离子

15、作为辅助因子。金属离子作为辅助因子。酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体Holoenzyme Apoenzyme金属离子金属离子稳定酶的构象；稳定酶的构象； 参与催化反应，传递电子；参与催化反应，传递电子；在酶与底物间起桥梁作用；在酶与底物间起桥梁作用；中和阴离子，中和阴离子，降低反应中的静电斥力等降低反应中的静电斥力等。小分子有机化合物小分子有机化合物参加催化过程，参加催化过程，在反应中起运载体在反应中起运载体的作用，传递电子、的作用，传递电子、质子或其它基团。质子或其

16、它基团。 以金属离子为辅助因子的酶的分以金属离子为辅助因子的酶的分类类金属酶金属酶(metal enzyme)： 金属离子与酶结合紧密金属离子与酶结合紧密金属激活酶金属激活酶(metal activated enzyme)： 金属离子不与酶直接结合，通过底物金属离子不与酶直接结合，通过底物相连相连金属酶金属酶金属金属离子离子金属激活酶金属激活酶金属金属离子离子碳酸酐酶碳酸酐酶羧基肽酶羧基肽酶过氧化物酶过氧化物酶过氧化氢酶过氧化氢酶己糖激酶己糖激酶磷酸转移酶磷酸转移酶锰超氧化物歧化酶锰超氧化物歧化酶谷胱甘肽过氧化物酶谷胱甘肽过氧化物酶ZnZn2+2+ZnZn2+2+FeFe2+2+FeFe2+2

17、+MgMg2+2+MgMg2+2+MnMn2+2+SeSe柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶丙酮酸激酶丙酮酸激酶丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶精氨酸酶精氨酸酶磷酸水解酶磷酸水解酶蛋白激酶蛋白激酶磷酯酶磷酯酶C磷酯酶磷酯酶A2K+K+ Mg2+Mn2+Zn2+Mn2+Mg2+Mg2+Mn2+Ca2+Ca2+一些金属酶及金属激活酶一些金属酶及金属激活酶 酶名称酶名称金属离子金属离子有机分子辅基有机分子辅基细胞色素氧化酶细胞色素氧化酶醇脱氢酶醇脱氢酶黄嘌呤氧化酶黄嘌呤氧化酶丁酰丁酰CoACoA脱氢酶脱氢酶琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶NADHNADH细胞色素还原酶细胞色素还原酶甲基丙二酰甲基丙二酰CoACoA异构酶异构酶

18、CuCuFe MoFe MoFe MoFe MoMoMoFeFeFeFeCoCo血红素血红素NADNAD+ +FADFADFADFADFADFADFMNFMN钴胺辅酶钴胺辅酶一些酶含有机分子辅酶和金属离子一些酶含有机分子辅酶和金属离子 酶名称酶名称金属离子金属离子有机分子辅基有机分子辅基细胞色素氧化酶细胞色素氧化酶醇脱氢酶醇脱氢酶黄嘌呤氧化酶黄嘌呤氧化酶丁酰丁酰CoA脱氢酶脱氢酶琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶NADH细胞色素还原酶细胞色素还原酶甲基丙二酰甲基丙二酰CoA异构酶异构酶CuFe MoFe MoMoFeFeCo血红素血红素NAD+FADFADFADFMN钴胺辅酶钴胺辅酶一些酶含有机分子辅酶

19、和金属离子一些酶含有机分子辅酶和金属离子按酶蛋白分子特点分为：单体酶、寡聚酶按酶蛋白分子特点分为：单体酶、寡聚酶和多酶复合物和多酶复合物1. 单体酶单体酶（monomeric enzyme)：仅有一条具有活性部位的：仅有一条具有活性部位的多肽链，全部参与水解反应。多肽链，全部参与水解反应。2. 寡聚酶寡聚酶 (oligomeric enzyme)：由几个或多个亚基组成，亚由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。共价键结合。3. 多酶复合物多酶复合物 (multienzyme system)：几个

20、酶镶嵌而成的复几个酶镶嵌而成的复合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。丙酮酸脱氢酶系（丙酮酸脱氢酶系（E.coli）：丙酮酸脱氢酶（）：丙酮酸脱氢酶（E）、硫）、硫辛酰转乙酰酶（辛酰转乙酰酶（E）和二氢硫辛酰脱氢酶（）和二氢硫辛酰脱氢酶（E）。）。EEE碱性EEE+EE+脲l 溶菌酶溶菌酶（lysozyme）l (130,129AA)130 荧光素酶荧光素酶 (luciferase) 大肠杆菌丙酮酸脱氢酶系大肠杆菌丙酮酸脱氢酶系回本章目录3.2 酶的结构及催化特点酶的结构及催化特点3.2.1 酶的结构酶的结构酶的活性中心酶的活性中心

21、(active center) 酶的必需基团在空间结构上彼酶的必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异地结合，并将区域，能与底物特异地结合，并将底物转化为产物，这一区域称为酶底物转化为产物，这一区域称为酶的活性中心。的活性中心。活性部位活性部位(active site) 按照酶活性功能，酶分子可以分为三个部分按照酶活性功能，酶分子可以分为三个部分 1.结合部位结合部位 Binding site 酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。结合部位决定酶的专一性。结合部位。结合部位决定酶的专一性

22、。2.催化部位催化部位 catalytic site 酶分子中促使底物酶分子中促使底物发生化学变化的部位发生化学变化的部位称为催化部位。催化称为催化部位。催化部位决定酶的催化能部位决定酶的催化能力力。按照酶活性功能，酶分子可以分为三个部分按照酶活性功能，酶分子可以分为三个部分 3.调控部位调控部位 Regulatory site 酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用。的变化，对酶起激活或抑制作用。按照酶活性功能，酶分子可以分为三个部分按照酶活性

23、功能，酶分子可以分为三个部分底底 物物 活性中心以外活性中心以外的必需基团的必需基团结合基团结合基团催化基团催化基团 活性中心活性中心 活性部位和必需基团活性部位和必需基团必需基团必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。酶的活性丧失。活性部位活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。催化作用直接有关的部位。必需基团必需基团活性部位活性部位 维持酶具有活性的空间结构维持酶具有活性的空间结构结合基团结合基团催化基团催化基团专一性专一性催化性质催化性质常见的必需基团有常见的必需基团有Ser的羟基，的羟

24、基，His的咪唑基，的咪唑基，Cys的巯基，的巯基，Asp、Glu的侧链羧基的侧链羧基 一些酶活性中心的必需基团一些酶活性中心的必需基团酶名称酶名称活性中心的必需基团活性中心的必需基团胰蛋白酶胰蛋白酶 His42,Ser180,Asp87弹性蛋白酶弹性蛋白酶 His57,Asp102,Ser195,Asp194,Ile16 羧基肽酶羧基肽酶 Arg145,Tyr248,Glu270 溶菌酶溶菌酶 Glu35,Asp52乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 Asp30,Asp53,Lys58,Tyr85,Arg101 Glu140,Arg171,His195,Lys250-胰糜蛋白酶胰糜蛋白酶 His57,As

25、p102,Asp194,Ser195,Ile16l活性中心的构象特点：活性中心的构象特点：在酶分子整个体积中只占比较小的一在酶分子整个体积中只占比较小的一部分，是一个三维实体，或为裂缝，部分，是一个三维实体，或为裂缝，或为凹陷。或为凹陷。多为氨基酸残基的疏水基团组成的疏多为氨基酸残基的疏水基团组成的疏水环境，形成疏水水环境，形成疏水“口袋口袋”。l酶的催化作用取决于活性中心酶的催化作用取决于活性中心大的疏水侧链芳香族氨基酸大的疏水侧链芳香族氨基酸碱性氨基酸碱性氨基酸( (赖氨酸和精氨酸赖氨酸和精氨酸) ) 小的疏水侧链氨基酸小的疏水侧链氨基酸3.2 酶的结构及催化特点酶的结构及催化特点3.2.

26、2 研究酶活性中心的方法研究酶活性中心的方法氨基酸氨基酸侧链基团侧链基团修饰剂修饰剂Lys氨基氨基三硝基苯磺酸，三硝基苯磺酸，2，4二硝基氟苯、碘二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸Asp、Glu羧基羧基水溶性碳化二亚胺水溶性碳化二亚胺Arg胍基胍基苯乙二醛，苯乙二醛，1,2环己二酮、丁二酮环己二酮、丁二酮Cys巯基巯基碘乙酸、碘乙酰胺、碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺乙基马来酰亚胺二硫键二硫键巯基乙醇、巯基乙醇、DTTHis咪唑基咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羟基酚羟基碘、四硝基甲烷碘、四硝基甲烷Trp吲哚基吲哚基N-溴代

27、琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺1、化学修饰法侧链基团修饰、化学修饰法侧链基团修饰2、X射线衍射法射线衍射法3、定点突变技术、定点突变技术4、蛋白酶水解法、蛋白酶水解法定点突变是指通过聚合酶链定点突变是指通过聚合酶链式反应（式反应（PCR）等方法向目）等方法向目的的DNA片段（可以是基因组，片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等删除、点突变等。3.2.3 酶的催化特点酶的催化特点3.2.3.1 酶和一般催化剂的共性酶和一般催化剂的共性酶具有一般催化剂的特征：酶

28、具有一般催化剂的特征：1.只能进行热力学只能进行热力学上允许进行的反应；上允许进行的反应；2.可以缩短化学反应到达可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；平衡的时间，而不改变反应的平衡点；3.通过通过降低活化能加快化学反应速度。降低活化能加快化学反应速度。l 高效率高效率比非催化高比非催化高1081020倍倍比非酶催化高比非酶催化高1061013倍倍l 反应条件温和反应条件温和l 酶催化是可调控的酶催化是可调控的l 高度专一性高度专一性酶催化作用的特点酶催化作用的特点FeClFeCl3 3酶作用的酶作用的专一性专一性结构专一性结构专一性立体异构专一性立体异构专一性族（基团）专一性

29、族（基团）专一性绝对专一性绝对专一性酶催化作用的专一性酶催化作用的专一性族专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。族专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。绝对专一性：只能作用于某一底物。绝对专一性：只能作用于某一底物。（相对专一性）（相对专一性）（structure specificity）（stereo specificity）Specificity回本章目录l学说认为：整个酶分子的天然构象是具有刚学说认为：整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样物的结合如同一把钥匙对一把锁一样3.3.

30、1 底物与酶的作用方式（专一性假说）底物与酶的作用方式（专一性假说）（1）锁钥学说）锁钥学说（lock and key，赫尔曼，赫尔曼，1894）局限性局限性（2）诱导契合学说）诱导契合学说(induced-fit theory)l该学说该学说认为认为酶表面并没有一种与底物互补的酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状。具有柔性。（互补形状。具有柔性。（丹尼尔，丹尼尔，19581958）群体移动模式群体移动模式l邻近效应：结合在酶活性部位上的底物分子邻近效应：结合在酶活性部位上的底物分子（A、B）中的反应基团相互靠近，使底

31、物在）中的反应基团相互靠近，使底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度。反应速度。l定向效应：酶催化基团与底物分子反应基团之定向效应：酶催化基团与底物分子反应基团之间，形成了正确的定向排列，使分子间的反应间，形成了正确的定向排列，使分子间的反应按正确的方向相互作用形成中间产物，从而降按正确的方向相互作用形成中间产物，从而降低了低了S分子的活化能。分子的活化能。 酶的活性中心部位，一般都含有多个起催酶的活性中心部位，一般都含有多个起催化作用的基团，这些基团在空间有特殊的排列化作用的基团，这些基团在空间有特殊的排列和取向，可以对底物价键的形变和

32、极化及调整和取向，可以对底物价键的形变和极化及调整底物基团的位置等起到协同作用，从而使底物底物基团的位置等起到协同作用，从而使底物达到最佳反应状态，或者说削弱了底物分子中达到最佳反应状态，或者说削弱了底物分子中的敏感键，产生键扭变，降低了底物反应的活的敏感键，产生键扭变，降低了底物反应的活化能，从而使反应速度大大加快。化能，从而使反应速度大大加快。3.3 酶的催化机制酶的催化机制3.3.2 酶的催化作用机制酶的催化作用机制1. 中间产物学说稳定过渡态中间产物学说稳定过渡态2. 酸碱催化酸碱催化3. 共价催化共价催化4. 金属离子催化金属离子催化P68-69P68-69回本章目录酶活力的测定方法

33、酶活力的测定方法A A、按反应时间分类、按反应时间分类 中止反应法中止反应法 连续反应法连续反应法 平衡法平衡法 1、分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有、分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有色物质或产物有紫外吸收的能力可采用此法。色物质或产物有紫外吸收的能力可采用此法。2、测压法：产物中有气体，测气压增加量。、测压法：产物中有气体，测气压增加量。3、滴定法：产物中有酸生成，用碱滴定。、滴定法：产物中有酸生成，用碱滴定。4、荧光法：产物中有荧光物质生成或产物与荧、荧光法：产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂反应生成荧光产物可用此法。光试剂反应生成荧光产物可用此法。5、旋光法：产物中有旋光物

34、质可采用此法、旋光法：产物中有旋光物质可采用此法。B、按照检测方法分、按照检测方法分3.4 酶的分离纯化及活力测定酶的分离纯化及活力测定3.4.1 酶的分离纯化参考蛋白质的分离纯化酶的分离纯化参考蛋白质的分离纯化3.4.2 酶的活力测定酶的活力测定酶反应速度：酶反应速度：通常用单位时间（通常用单位时间（t）内底物（内底物（S）的减少量或产物（）的减少量或产物（P）的）的增加量表示，即增加量表示，即比活力：比活力：单位重量的蛋白质中所单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数具有酶的活力单位数,一般用一般用IU/mg蛋白质或者蛋白质或者IU/ml酶蛋白来表示。酶蛋白来表示。 酶活力：酶活力：是指在一

35、定条件下，是指在一定条件下， 酶所催化的反应初速度。酶所催化的反应初速度。 d S d Pu = - - = -u = - - = - d t d t酶活力单位的定义酶活力单位的定义 1961年国际生物化学与分子生物学联合年国际生物化学与分子生物学联合会规定：在特定条件下（温度可采用会规定：在特定条件下（温度可采用25或或其它选用的温度，其它选用的温度，pH等条件均采用最适条等条件均采用最适条件），每件），每1 min 催化催化1 mol 的底物转化为产的底物转化为产物的酶量定义为物的酶量定义为1 个酶活力单位。这个单位个酶活力单位。这个单位称为国际单位（称为国际单位（IU）。）。底物浓度对酶

36、促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响3.5 酶促反应动力学酶促反应动力学n在低底物浓度时在低底物浓度时, 反应反应速度与底物浓度成正比，速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。表现为一级反应特征。n当底物浓度达到一定值，当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到结合后，反应速度达到最大值（最大值（Vmax），此时），此时再增加底物浓度，反应再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为速度不再增加，表现为零级反应。零级反应。02468101214161820020406080100Concentration of Substrate(um ol/L)

37、Rate of Reaction(v)3.5.1 米氏方程米氏方程V=Vmax SKm + SnKm 即为米氏常数，即为米氏常数，nVmax为最大反应速度为最大反应速度n当反应速度等于最当反应速度等于最大速度一半时大速度一半时,即即V = 1/2 Vmax, Km = Sn上式表示上式表示,米氏常数米氏常数是反应速度为最大值是反应速度为最大值的一半时的底物浓度的一半时的底物浓度n因此因此,米氏常数的单米氏常数的单位为位为mol/L1913, Michaelis & Menten3.5 酶促反应动力学酶促反应动力学-4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/m

38、m ol.L-1)1/v斜率斜率=Km/Vmax-1/Km1/Vmax米氏常数的求法米氏常数的求法 酶的催化作用受到底物浓度、酶浓酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、度、温度、pH值、激活剂浓度、抑制剂值、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。在酶的应用过浓度等诸多因素的影响。在酶的应用过程中，必须控制好各种环境条件，以充程中，必须控制好各种环境条件，以充分发挥酶的催化功能。分发挥酶的催化功能。3.5.2 影响酶催化的各种因素影响酶催化的各种因素研究影响酶催化作用的因素的方法研究影响酶催化作用的因素的方法 研究某一因素对酶促反应速度的影研究某一因素对酶促反应速度的影响时，应在保持其它因素

39、不变的情况下，响时，应在保持其它因素不变的情况下，单独改变研究的因素单独改变研究的因素单因子变量单因子变量。反应速度反应速度酶的浓度酶的浓度(一一) 酶的浓度对酶促反应的影响示意图酶的浓度对酶促反应的影响示意图在底物浓度足够大的前提下在底物浓度足够大的前提下（二）底物浓度对酶促反应的影响示意图二）底物浓度对酶促反应的影响示意图反应速度反应速度底物的浓度底物的浓度（三）温度对酶促反应的影响示意图（三）温度对酶促反应的影响示意图反应速度反应速度最适温度最适温度温度温度（四）（四）pH对酶活性的影响示意图对酶活性的影响示意图 PHPH6 61010最适最适PHPH值值2 2反应速度反应速度( (以人

40、为例以人为例) )S Sv v1.竞争性抑制（竞争性抑制（ v对对S作图）作图）无抑制剂无抑制剂KmKmKmKm变大变大VmVm不变不变竞争性抑制剂竞争性抑制剂1.1.竞争性抑制（双倒数作图）竞争性抑制（双倒数作图）I1/ v-1/ Km1/ S1/ Vm增大增大正常正常1.竞争性抑制（双倒数作图）竞争性抑制（双倒数作图）2.非竞争性抑制（双倒数作图）非竞争性抑制（双倒数作图）I1/ v-1/ Km1/ S加大加大正常正常Km不变不变Vm变小变小2.非竞争性抑制（双倒数作图）非竞争性抑制（双倒数作图）3.反竞争性抑制（双倒数作图）反竞争性抑制（双倒数作图）3.反竞争性抑制（双倒数作图）反竞争性

41、抑制（双倒数作图）I1/ v-1/ Km1/ S1/ Vm增大增大回本章目录正常正常3.6 酶工程的新进展：几种重要的酶酶工程的新进展：几种重要的酶 也称变构酶，其分子构象可以受效应也称变构酶，其分子构象可以受效应物（物（effector）的作用而改变，从而使自身）的作用而改变，从而使自身的催化活性改变。的催化活性改变。别构酶的特征：别构酶的特征： 1、是寡聚酶，由若干个亚基组成。、是寡聚酶，由若干个亚基组成。 2、既有活性中心，也有变构中心。、既有活性中心，也有变构中心。 3、其动力学不符合米氏方程。、其动力学不符合米氏方程。一、别构酶（一、别构酶（allosteric enzyme）:核糖

42、核苷酸还原核糖核苷酸还原酶是一种变构酶，酶是一种变构酶，包括包括R1、R2两个两个亚基，只有亚基，只有R1与与R2结合时才具有结合时才具有酶活性（反应过酶活性（反应过程见图）程见图） 是存在于同一种属生物或同一个体中能是存在于同一种属生物或同一个体中能催化同一种化学反应，但酶分子的结构及理催化同一种化学反应，但酶分子的结构及理化性质和生化特性（化性质和生化特性（Km、电泳行为）存在明、电泳行为）存在明显差异的一组酶。显差异的一组酶。二、同工酶（二、同工酶（isoenzyme）: 同工酶广泛存在于生物界，作为遗传标同工酶广泛存在于生物界，作为遗传标志，已广泛应用于遗传分析；农业上同工酶志，已广泛

43、应用于遗传分析；农业上同工酶分析法已用于优势杂交组织的预测。分析法已用于优势杂交组织的预测。碱性磷酸酶电泳扫描及图谱碱性磷酸酶电泳扫描及图谱正常人血清中主要为肝正常人血清中主要为肝ALP，其次为骨，其次为骨ALP和小肠和小肠ALP 三、人工酶和模拟酶三、人工酶和模拟酶人工模拟酶（人工模拟酶（enzyme of artificial imitation）即根据酶的作用原理）即根据酶的作用原理 ，用人，用人工方法合成的具有活性中心和催化作用工方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白质结构的化合物的非蛋白质结构的化合物l抗体酶又称催化抗体（抗体酶又称催化抗体（catalytic antibody），

44、是一种新型人工酶制剂，），是一种新型人工酶制剂，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是免疫球蛋力巧妙结合的产物，本质上是免疫球蛋白，但是在其可变区赋予了酶的属性。白，但是在其可变区赋予了酶的属性。l抗体酶是生物学与化学的研究成果在分抗体酶是生物学与化学的研究成果在分子水平上交叉渗透的产物。子水平上交叉渗透的产物。科学家发现科学家发现HIV致命弱点：抗体酶有效裂解致命弱点：抗体酶有效裂解gp120一一段编号为段编号为421-433421-433的氨基酸序列是在的氨基酸序列是在HIVHIV（艾滋病毒）的外膜糖蛋白（艾滋病毒）的外膜糖蛋白gp1

45、20gp120上被发现的上被发现的 CD4CD4受体受体lHIV通过外膜糖蛋白通过外膜糖蛋白gp120吸附于吸附于CD4受受体上，此受体主要存在于人类体上，此受体主要存在于人类T4淋巴细淋巴细胞上，并将人体免疫系统中最重要的胞上，并将人体免疫系统中最重要的T4淋巴细胞作为攻击目标，大量吞噬、破淋巴细胞作为攻击目标，大量吞噬、破坏坏T4淋巴细胞，从而破坏人的免疫系统，淋巴细胞，从而破坏人的免疫系统，最终使免疫系统崩溃，使人体因丧失对最终使免疫系统崩溃，使人体因丧失对各种疾病的抵抗能力而发病并死亡。各种疾病的抵抗能力而发病并死亡。 1 1、酶在医药方面的应用、酶在医药方面的应用2 2、酶在食品方面

46、的应用、酶在食品方面的应用3 3、酶在轻工、化工方面的应用、酶在轻工、化工方面的应用 4 4、酶在环境保护中的应用、酶在环境保护中的应用5 5、酶在生物技术领域的应用、酶在生物技术领域的应用3.7 3.7 酶的应用酶的应用用酶进行疾病的诊断用酶进行疾病的诊断用酶进行疾病的治疗用酶进行疾病的治疗用酶制造各种药物用酶制造各种药物药用酶的治疗作用药用酶的治疗作用 由于体内有害物质的积累所引起的疾病，可以用酶由于体内有害物质的积累所引起的疾病，可以用酶来消除毒物。来消除毒物。(脲酶脲酶,尿毒症尿毒症) 由于酶功能不正常、或者酶缺乏、酶量不足所产生由于酶功能不正常、或者酶缺乏、酶量不足所产生的疾病，可以用酶来调整酶作用，或者补酶量的疾病，可以用酶来调整酶作用，或者补酶量 癌细胞内异常的生化环境可用酶来破坏，以杀死癌癌细胞内异常的生化环境可用酶来破坏，以杀死癌细胞（细胞（L天门冬酰胺酶针剂）天门冬酰胺酶针剂） 由于细菌、病毒引起机体产生的疾病，可以用抗生由于细菌、病毒引起机体产生的疾病，可以用抗生素抑制微生物代谢所需要的酶，使微生物死亡，从素抑制微生物代谢所需要的酶，使微生物死亡，从而恢复人体健康而恢复人体健康 天门冬酰胺通常并非必需氨基酸，但某些天门冬酰胺通常并非必需氨基酸，但某些肿瘤细胞肿瘤细胞(如淋巴白血病细胞等如淋巴白