Western-blot实验操作步骤

1、Western blot实验步骤一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取）1 倒掉细胞培养液，加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS后 将细胞培养瓶置于冰上。2. 裂解液RIPA （强）1ml +PMSF10ul （100:1），两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。3. 裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中.4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续 实验（-80保存）常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再 加入1ml PBS,用细胞刮轻轻刮

2、取细胞，转移至1.5ml ep管中， 12000rpm,离心5min,尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实 验。融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充 分混匀，冰上裂解20min, 4度离心，5min , 12000rpm,小心吸取上清 至新的ep管中。二、蛋白浓度测定（BCA法）BCA （碧云天）蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml ,最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul o在50- 2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。标准蛋白BSA浓度：5mg/ml （20保存），完全溶解蛋白标准品，取10ul稀释

3、至100ul ,使终浓度为0.5mg/ml （ug/ul）。蛋白样品在什么 溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但为了简便起见，也可以用 09%NaCl或PBS稀释标准品。1. 配置BCA工作液A液：B液=50 : 1 ,混匀A液+B液=200ul （每个样本）样本数量：7个标准品+ N个待测蛋白样本2. 先将每孔加入200ulBCA工作液，再加入蛋白样本。（96孔板）总体积为10uL待测蛋白样本先10倍稀释96孔编号#1#2#3#4#5#6#7BSA标准蛋白Oul1ul2ul4ul6ul8ul10ulddH2O10ul9ul8ul6ul4ul2ulOul96孔待测蛋 白样本1待测蛋 白样本2待

4、测蛋白 样本3待测蛋 白样本 N10ul/ well3.37度，温箱中孵育30mino 562nm波长，测OD值。待测蛋白样品浓度 在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。4. 根据所测样品的OD值，绘制标准曲线。根据标准曲线即可计算样本相 应的蛋白含量，除以样本稀释液总体积（10ul ）,再乘以样本稀释倍数， 即为样本的实际浓度（Ug/ul ）5 蛋白定量后，以最小蛋白浓度为标准，将各组蛋白样本调至相同浓度（ddH20 补齐）绘制标准曲线：X轴为蛋白质量，Y为0D值插入一 XY散点图，选中图上一点，右键，添加趋势线一选项（显示公式，显示R2, R2>0.99有意义）三、蛋

5、白变性1. 室温融解SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（漠酚蓝染料）（2x或5x ）2. 将适量蛋白样本与SDS-PAGE上样缓冲液混合，使其终浓度为1x3.100度或沸水煮3-5min ,充分变性蛋白。冷却至室温后，直接上样到 SDS-PAGE胶加样孔内即可。或冷却后-80保存用于后续实验。四、蛋白电泳1. 配胶：根据配胶试剂盒操作步骤，按照目的蛋白分子量大小，选择相 应浓度的分离胶。配胶时最后加10%过硫酸鞍和TEMED每.板分离胶 5ml,浓缩胶3ml.短板在内侧。配好后如暂时不用，可将胶板取下，电 泳液中浸泡，4度保存。2. 配电泳液1x甘氨酸-Tris电泳缓冲液1LTris 3.03g甘

6、氨酸14.4gSDS1g3. 蛋白上样：样本10-30ul （保证蛋白质量最少为30ug） 20-25ul蛋白 Marker 5ul选择较好的孔加样，并记录加样位置4. 连接电极，跑电泳：电泳条件80V,30min （蓝色条带到达浓缩胶底部）110V,90min （参考Marker的位置，蓝色条带跑到胶底部即可）五、转膜1 配转膜液：1L Tris 3.03g甘氨酸14.4g,加水至800ml,最后加甲醇200ml,调至总体积为1L.2. 切胶：起胶时将胶留在长玻璃板上，将裁减好的膜做好标记后浸泡在 转膜液中。确定目的蛋白的位置（根据Marker条带），切胶，保留目的 蛋白位置，将膜置于胶上，膜数字面在上，背面与胶相贴，数字标记端贴 在 Marker 上。3. 准备转膜：按如下顺序阴极（黑）4. 连接电极，转膜：90V,90min六、封闭1. 配封闭液:0.5g脱脂奶粉+ 10ml PBS2. 取下膜，注意蛋白在膜与胶贴合的一面，取下后将膜有蛋白面朝下, 封闭1小时 七、抗体孵育配抗体稀释液：0.5g脱脂奶粉，10ul Tween, 10ml PBS配洗膜液：100ul Tween + 100ml PBS一抗孵育，4度过夜次日，洗膜液洗4次，