Westernblot试剂配制及操作流程

1、Western-Blot操作流程试剂配制蛋白提取试剂1. RIPA裂解液:10mM Tris (,)1%NP40%Trit on X-100% 兑氧胆酸钠2 mM EDTA1 mM PMSF20%甘 油调pH值至。cooktail 。混匀后4 C保存，长期保存于-20 C。使用时，加入蛋白酶抑制剂工作液制胶用（1-6）:1. L Tris HCI （）Tris 12.114g蒸馏水100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至），室温下保存。2. L Tris HCI （）Tris 18.671g蒸馏水100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至），室温下保存。3. 10 % SDSSDS 10g蒸馏水至 10

2、0ml如溶解困难，可在50C水浴下溶解，室温保存 如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用4. 10 %过硫酸胺（AF）过硫酸胺蒸馏水 1ml（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在管中，一次性多装几管，使用时加 入蒸馏水水即可，溶解后，4C保存，保存时间为1周）5. 四甲基乙二胺原液（TEME）4?C保存。6. 30初稀酰胺:4?C保存。10%F层胶，即分离胶（两块胶，15ml):胶的浓度根据自己所做蛋白的大小确定依次加入去离子水30%烯酰胺5ml1.5M Tris-HCI()10%SDS150口 I10%AP150口 ITEMED6口 I每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过

3、硫酸胺和TEME量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入 TEME混匀后应即刻灌胶。灌胶后加异丙醇（1ml）消泡 5%上层胶（两块胶，6ml）:依次加入去离子水30%丙烯酰胺1ml1M Tris-HCl ()10%SDS60口 l10%AP60口 lTEMED6口 l每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEME量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEME混匀后应即刻灌胶。7. 5X电泳液缓冲液Tris ()15.1g甘氨酸（）94gSDS5.00g蒸馏水至1000ml溶解后室温保存，用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。& 10X转膜缓冲液甘氨酸（）T

4、ris （）30.3g蒸馏水至1000ml溶解后室温保存，用时稀释10倍，并加入甲醇至20%（先加甲醇易通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可 产生沉淀）9. 10XTB缓冲液Tris （）24.2gNaCI80.0g蒸馏水至1000ml（浓盐酸调pH至），溶解后室温保存10. 1XTBS缓冲液10XTB缓冲液100ml蒸馏水 900mlTwee n-201 ml因Twee n-2 0比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡 溶解后室温保存。11 .封闭液/抗体稀释液（5%兑脂牛奶）:1XTBST 缓冲液 95-100 ml脱脂奶粉 5

5、g溶解后4C保存，可于一周内使用步骤：SDS- PAG电泳（ 1） 清洗玻璃板：两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。（ 2） 灌胶与上样1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。2、按前面方法配12%下层胶（15ml，两块胶，每块胶在7ml左右），加入TEME后立即摇匀即可 灌胶。 灌胶后胶上加一层异丙醇醇（1ml左右），液封后的胶凝的更快。3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。弃去异丙醇，用水冲洗，并用吸水纸将水吸干。4、 等待胶凝期间可计算含10-100ug蛋白的溶液体积即为上样量 （根据自己的实验 需要进行选择, 没有固定的量）取出上样样品

6、至EP管中，加入5X上样缓冲液至终浓度均为IX。上样前要将样品于沸水中煮5-10min使蛋白变性。5、 按前面方法配5%的上层胶（6ml，两块胶），加入TEME后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌 满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中（从梳子的一头开始插）。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。 插梳子时要使梳子保持水平。 由于胶凝固时 体积会收缩减小（也提示胶已经凝固），从而使加样孔的上样体积减小，所以在上层胶凝固的过等待上层胶凝固期间配制1X电泳缓冲液。6、 加入1X电泳缓冲液，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。*电泳缓冲液一定要 加至超过玻璃板的上缘（量要足够多），否则电泳期间会

7、出现电流过低的现象，进而影响电泳 的效果。7、上样Marker 7 口 I样本根据自己的样品决定实验所用 Thermo 26619# Marker电泳后出现 9条带：10, 15, 25, 35, 55, 70, 100, 130, 250KDa（具体条带数目会因为胶的浓度不同而不同），最少4条带（6%的分离胶时出现 70， 100， 130，250KDa）。（3）电泳：幵始恒压，电压80V,电泳跑到分离胶以后可调节电压到120V电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜（一般要让目的条带跑过分离胶的1/3比较好）。电泳结束前20分钟配制1X转膜缓冲液。（四）转膜1 ） 转一张膜需准备 4张滤纸

8、和 1 张硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套 （因为手上的蛋白会污染膜）。将切好的硝酸纤维素膜现在甲醇中浸 泡激活，后和滤纸置于1X转模缓冲液浸湿。（2） 夹子黑的一面：海绵-2张滤纸-胶-PVDF莫-2张滤纸-海绵（顺序一定注意）将夹子打幵使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在垫子上垫二层滤纸，先将玻璃板撬幵，随后将浓缩胶轻轻刮去， 小心剥下下层胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐， 轻轻用玻棒擀去气泡。将硝酸纤维素膜盖于胶上， 要盖满整个胶并 除 气泡。在膜上盖2张滤纸并除去气泡（膜盖下后不可再移动）。最后盖上另一个海绵垫，擀几下 就可合起夹子。要

9、不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。如果同时做两块胶，转膜的时候应记住样本的位置。（3）将夹子放入转移槽槽中，要使 夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产 热，故放冰来降温。一般用恒流400mA专膜。实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，如果同时做两块胶，转膜结束应在膜上做标记，以便查询相应样本。转膜后，膜要分正反面，转膜时靠胶的一面为正面。转膜结束前配制封闭液（5%兑脂牛奶）及1X TBST缓冲液。如果做磷酸化抗体等，需要用血清封 闭，具体情况可参考抗体说明书。1-2h（五）免疫反应（1）封闭：将膜用移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭

10、(2) 抗将一抗用封闭液稀释至适当浓度；加入抗体， 4度过夜， 次日用1X TBST在室温下脱色摇 床上洗三次，每次5min。（3）二抗同上方法准备二抗稀释液，室温下孵育1-2h后，用1X TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。（六）化学发光，显影，定影（1）将A和B两种试剂等量等体积混合；打幵X-光片夹，铺上保鲜膜，将膜正面朝上放于保鲜膜上，滴加此混合液1-3min后（见到荧光）（2）将1 X显影液，自来水和定影液分别到入盘中；在红灯下取出X光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）;把乂一光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上 X-光片夹，幵始计时；根据信号的强弱适当调整曝光 时间，一般为1mi n到5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打幵X-光片夹，取出X-光片，迅