干细胞治疗糖尿病的研究近况

1、干细胞治疗糖尿病的研究近况关键词糖尿病干细胞胰岛 健康讯：魏雪峰 史小林100054首都医科大学生殖医学研究中心【摘要】本文对本世纪以来干细胞治疗糖尿病的若干研究，包括胰岛的体内发育、分化及其标志物，以及应用胰导管干细胞和胚胎干细胞进行定向诱导分化为胰岛对糖尿 病进行细胞治疗的实验进行了综述。随着干细胞技术的不断完善，人类最终能治 愈糖尿病。 全球糖尿病（diabetes mellitus , DM患者约亿（我国也已 达4000万），预计2025年将达3亿1,已成为严重危害人类健康的重大疾病 之一，特别是久病引发的多系统损害，及最终的肾功能衰竭。DM发病机制复杂，涉及遗传、环境、免疫调控和化学

2、因子。自1922年发现了胰岛素至今，DM勺治疗以药物和注射胰岛素为主，目前，学者们开始关注经胰岛移植恢复患 者体内代谢紊乱的方法，但因组织来源匮缺，制约了胰岛移植研究的开展，因此 寻找合适的胰岛移植物的研究便成为了当务之急。随着分子、细胞和发育生物学 技术的进展，增加了干细胞定向诱导分化成胰岛的可能性但由于这一技术还处于 实验室的实验阶段，而且方法也并不统一，因此有必要将近期研究进行汇总，希望能对在这方面进行研究的同僚们有所帮助。1胰岛体内的形成、发育、分化与鉴定胚胎胰岛分化 胚胎胰岛的分化分4个阶段：（1）胚胎910周为零散的多激素细胞阶段；（2）胚胎1115周为未成熟的多激素阶段；（3）胚

3、胎 1619周为单激素核心胰岛阶段；（4）胚胎30周后为多形胰岛阶段（Bocian, Histochem Cell Biol , 1999）。在胰岛形成过程中，内胚层细胞形成许多小导管， 其末端膨大部分的细胞团发育为外分泌腺泡，与此同时，一些细胞群或细胞索不出现管腔，卷曲成团并与其他细胞索分离开，分散在腺泡之间，内含丰富的毛细 血管，最后发育成具有内分泌功能的胰岛。胰岛细胞分化的调节Ferber 2认为胚胎发育早期的信号源于脊索，后期的信号源于问质，经诱导的胰管上皮细 胞增殖分化形成胰岛细胞，但至今为止其诱导因素并无统一认识。PDX1l种同源框转录因子（homeoboxtran scripti

4、on factor ）,即胰十二指肠同源异 型盒基因（pa-ncreatic and duodenal homeobox1 ）,编码胰腺十二指肠同源框 蛋白 1,又称 IPF-1、IDX-1、IUF-1。Lu （Lu, Endocrinology , 1996）认为 PDX1 是胰腺发育及胰岛素基因转录表达的关键性转录因子，即决定于胰腺前体细胞向 B、A、D细胞的分化。Mckinnon 3 认为PDX1 寸于肠内胚层背胰芽和腹胰芽的生长、分化起重要作用。Dutta 4 认为早期胰腺表达的PDX-1对胰腺 上皮的形成和分化是必需的。Gu 5 认为所有胰腺细胞均来源于PDX1表达 的前体细胞，是最

5、先发现的胰腺发育决定基因，随着胰腺发育 PDX1的表达逐渐 减弱，如缺失将导致胰腺无法形成。 Docherty 6 的研究证实小鼠PDX1基 因的纯合子缺失、突变会导致胰腺无法形成。ngn3:ngn3即神经元素3(neurogenin3 ),是胰腺发育过程中短暂表达的蛋白， 可能是胰腺内分泌细胞系 的定向因子，且在成熟胰岛中不存在。用PDX1启动子促进转基因小鼠中早期胰腺前体细胞中ngn3表达，会导致内分泌细胞数增加，外分泌细胞数减少。ngn3缺失的纯合子小鼠中胰岛细胞和 nestin+胰岛前体细胞在发育各阶段都缺失6。Lee 7认为ngn3基因与胰岛分化有密切关系，因为 ngn3基因缺陷小鼠

6、不能表达胰岛其他特异性转录因子，包括islet1 、PAX4 PAX6而缺乏PAX6 Neu- roD1、或的动物胰腺中表达ngn3,表明ngn3位于这些因子的上游， 且对启动内分泌细胞分化必不可少，而分化后期关闭。Gasa 8通过表达的腺病毒感染胰腺导管细胞，建立了体外调控分化模型，发现 ngn3和NeuroD1活 化胰岛分化的基因并不重叠，表明这两个bHLH蛋白在胰岛发育活动中具有不同的功能。Mellitzer 9 通过将cDNA雨入至U前体细胞的3'端非翻译区，通 过EYFPt位NGN-3s达，发现内分泌前体细胞在缺乏问充质信号刺激情况下， 可在体外扩增，向内分泌细胞分化为其默认

7、的途径。Leon 10用抗新霉素基因筛选用含前体基因质粒转染鼠胚胎干细胞。培养后用筛选阳性细胞，发现这些细胞分泌胰岛素，注入糖尿病鼠体内可使其血糖恢复正常。Fox a 2:内分泌的关键调控基因是forkhead基因Fox a 2。Guo 11 诱导内胚层分化的研 究发现，Fox a 2可被Foxd3激活，而被Oct4抑制。内胚层分化可通过抑制 Oct4 表达实现。Fox a 2基因关键参与肺、肝、胰发育。缺乏 Fox a 2基因，鼠不能产 生前、中肠内胚层(Ang, Cell , 1994)。HNF:HNF参与肝、肠、胰分化，缺失可致年轻人成熟期发病的糖尿病( Maturity onset d

8、iabetes melli - tus in young, MODYt HNF1a (TCF1) HNF贼 Fox a 2 及 Pdx-1 双杂合缺失，导致 0 细胞功能缺陷，提示这些基因构成B细胞发育的基因络(Yamagata, Nature ,1996) 0HNF6-/-鼠，腹胰发育缺陷及胆管发育异常，该基因需ngn3激活(Yamagatq Nature , 1996)。HNF6®激活 Fox a 2a 基因。Pax:Pax-4 和 Pax-6 同属 Pax基因家族，其在胰腺内分泌细胞分化中起关键作用。Sosa (Sosa, Nature , 1997) 将Lac-Z插入到Pax

9、基因中作标记，发现Pax-4失活的新生鼠经免疫组织化学法 显示缺少B细胞和6细胞，a细胞排列不规整。Pax-6缺失，a细胞缺如， 而胰岛素和生长抑素分泌细胞却可出现(St-Onge, Nature , 997)。由此推断出 Pax-6是a细胞发育所必需，而非B、6细胞发育所必需。Chiang 12为分析单个胰腺细胞的转录模式，改进了基于PCR勺cDNAT增方法，即将单个胰腺细胞中的cDNAf含有95个常见胰腺细胞表达基因的 DNA5片进行杂交，芯 片上的基因包括转录因子，信号传导分子以及对照基因。研究者观察了胚胎小鼠 的胰腺分离出的单个细胞中的基因表达模式。在这个时期上皮细胞的形态均一， 而基

10、因表达模式分析可分为6个不同的亚型。I型只表达Pdx1,和，II型还表 达P48, III型还表达ngn3。因为Pdx1是最早表达的胰腺脏细胞标记蛋白，因 此研究者认为I型细胞是最好的胰腺干细胞候选者。II型细胞表达的P48是外 分泌胰腺细胞的标记，而和是内分泌细胞分化所必须的。 研究者根据这些研究结 果推测出一个胰腺细胞分化的模型， 每一个阶段都对应相应的基因表达模式。此外，成体的胰岛内分泌细胞4050d更新一次，其过程包括细胞凋亡和胰导管干 细胞增殖分化成新的胰岛细胞。给予葡萄糖或高血糖素样肽( Glucagon-like peptied , GLP1等促胰岛因子48h后，胰岛细胞数量可增

11、加一倍，说明机体胰 岛在一定的条件与需求下进行着不断更新与增殖的(Rosenberg, Cell Transplant , 1995)。胰岛前体细胞的标记 Jindal (Jindal ,Transplan ration Proceeding , 1997)认为胰脏的外分泌细胞和内分泌细胞都 来源于具有导管细胞特征的未分化上皮细胞， 提示胰导管细胞可能是胰岛的前体 细胞。Berger 13也发现胰腺中存在干细胞，认为胰腺干细胞是胚胎发生中没有进行终末分化的胰腺细胞，具有自我更新和分裂能力。应用HE染色显示该细胞是一种嗜碱性的单核细胞， 直径约8mi呈圆形，细胞核为圆形或肾形， 较大，多含2个核

12、仁，染色质细腻而分散，胞质中不含颗粒，在形态上与小淋巴 细胞极为相似。近年来的研究揭示了胰岛前体细胞的特异性标记物，这对胰岛前体细胞的提取将有很大的帮助，目前较为公认的特异性标记物有以下几种， 还有很多标记物有待于发现。酪氨酸羟化酶(tyroxine hydroxy - lase , TH): 在大鼠胰腺发生中表现出发育依赖性变化。第16天胚胎的导管细胞可见TH的表 达，但成熟的内分泌细胞中却难以检测到 TH,胎儿和刚出生幼儿的胰岛细胞和 一些导管细胞TH呈阳性。成年大鼠胰腺中，TH仅在B细胞中表达。TH的这种 表达模式可用于鉴别内分泌前体细胞14 o葡萄糖转运子2 (glucosetrans

13、porter , Glu T-2 ):可在大鼠胚胎的背胰芽和腹胰芽细胞中检出，并在胰 芽发育中持续表达。孕17d,可检测到细胞内表达 GluT-2和胰岛素，以后，这 些细胞聚集形成胰岛的B细胞群，而那些将转变成腺泡细胞的细胞不再表达 GluT-2 15。细胞角蛋白20 (cytokeratin , CK20 :CK20是成熟胰腺导管细胞的一个特异标志。在胎鼠和幼鼠的导管细胞和内分泌细胞中表达，而在成年动物的导管细胞中有CK20表达则提示能定向分化成内外分泌细胞的胰腺未分化 细胞。诱导与导管连接的B细胞再生时，CK2她可在内分泌细胞中表达，显示了未分化细胞分化为内分泌细胞的过程15 °

14、PDX-1:是B细胞成熟的标志。在哺乳动物中，这种同源域蛋白(homeodomain protein )是一种调节胰岛素和 抑生长素表达的转录因子，也作为胰岛素启动因子-1 (IPF-1)、抑生长素活化因 子-1 (STF-1)和胰岛十二指肠同源域蛋白(IDX-1)而存在。PDX-1也可在尚未 形成胎儿胰腺上皮细胞的所有胰岛素分泌细胞中短暂表达(Bouwens, 1998)。 Kit:Kit在胰岛素细胞系中表达，认为在信号转导方面起作用。胎鼠和成鼠的胰 岛中均可检测到Kit ,经Kit基因表达的标记物gal证实，Kit在胰岛素细胞中 特异表达，在其他内分泌细胞和外分泌细胞中不表达16 o ng

15、n3:ngn3阳性细胞散在于胎鼠胰腺的导管细胞，胚胎达高峰，成熟胰岛细胞则转为阴性17o由于胰岛激素或成熟内分泌细胞不表达 ngn3,因此ngn3阳性细胞可作为胰腺内分泌细胞的前体细胞的标记物18。波形蛋白(vimentin ) :Schmied 19将长期培养的胰岛细胞去分化得到未分化的导管样上皮细胞，这些细胞可分化成胰腺内外分泌细胞，并限制性表达波形蛋白， 所以波形蛋白可作为胰岛祖细胞的分子标志。但在此需说明的是，最近研究人员用小鼠做了详细的追踪研究，Matthews 20通过孕鼠及乳鼠喂养不同剂量的维生素A,发现缺乏维生素A, B细胞数量和体积明显下降。ChenY 21 等发现SOCS-

16、K-/-)鼠感染后外分泌部细胞死亡高于内分泌部，可能 T干扰 素或月中瘤坏死因子促进内分泌部增生分化。Gesina 22通过糖皮质激素治疗通过转基因技术使激素受体缺陷的鼠，发现胰岛素分泌细胞减少是外分泌细胞的 2倍，提示糖皮质激素有利于向外分泌分化。表达 Pax-1, Pax-6,处下游调控序 列，而paf-1-p48和Hes-1的mRNAf高。选择非活化激素受体基因，在鼠0细 胞无明显效果。而对于缺乏糖皮质激素受体，且表达 Pdx-1则B细胞群增长加 倍。胰岛细胞数量和体积均增大而a细胞除外。提示糖皮质激素在胰腺B细胞分化中具有重要作用。2诱导干细胞分化为胰岛的研究近况应用生物工程技术获取胰

17、岛素分泌细胞可从以下几个途径：(1)胰导管干细胞；(2)胚胎干 细胞；(3)利用基因工程技术。但将这些细胞诱导成胰岛，仅是实验室研究的初 级阶段，并不是最终的成果。胰导管干细胞应用(1) Peck 23和Ramiya 24 分离、提取出了存在于胰腺导管中的胰岛干细胞，经体外诱导 培养形成了胰岛样细胞。(2) Bonner 25发现角质化细胞生长因子(keratinocyte growth factor , KGF 和烟碱(nicotine )对导管干细胞分化 为胰岛产生作用。(3) Ramiya 26从胰腺导管上皮细胞诱导分化得到“产生胰岛的干细胞(islet producing stem c

18、ells , IPSCs) ”，这些 IPSCs 呈较 典型的胰岛样结构，并对高浓度葡萄糖有胰岛素释放应答反应，免疫组织化学染色证实有胰岛素和胰高糖素的表达，RT-PCF®示这些细胞能表达许多胰岛细胞的标志性基因，如胰岛素基因，胰高糖素，生长抑素，GLUT级谷氨酸脱竣酶等。 将分化成熟的胰岛细胞移植到 NODI体内，可完全逆转其DM犬态25。由 IPSCs可诱导分化得到“产生胰岛的细胞” (islet producing cells , IPCs), IPCs可分化成有组织结构的胰岛细胞团，包括A、B、D细胞，表达一系列胰岛标志，分泌胰岛素并受葡萄糖诱导。将这些细胞移植到NODS体内

19、，可稳定其血 糖水平。胚胎干细胞应用(1) Lumelsky 27采用胚胎干细胞体外扩增后，筛选巢蛋白(nestin )阳性细胞，加入碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor , bFGF及B27和尼可酰胺，诱导成为能分泌胰岛素 的胰岛样结构，将其植入糖尿病鼠体内，可使血糖降低且有血管形成，只是胰岛 素分泌量较低。(2) Assady 28 从ES细胞诱导分化得到可分泌胰岛素的细 胞，他们的方法是先将 ES细胞在有白血病抑制因子(leukaemia inbibitory factor , LIF)存在，但无滋养层的条件下培养，此时有 PDX1 (pa

20、ncreatic and duodenal homeobox1)表达，然后在无LIF的条件下促进ES细胞增殖分化为拟 胚体(EmbryoBodys, EBs),再在无血清环境下培养，提高nestin+细胞的比例， 加入bFGF继续培养，得到类胰岛组织细胞。这些细胞表达145pgN g的鼠胰岛素 I和H,而且其表达受葡萄糖诱导，还表达胰岛淀粉多肽(isleta myloid polypep tide ) , GLUT冷胰岛细胞标志。但将这些细胞移植入糖尿病小鼠后， 未能使其血糖正常化。(3) Sori a 29通过转基因技术将基因插件插入到小 鼠胚胎干细胞中，经潮霉素(hygromycin )筛

21、选，获得含上述基因插件的干细胞， 扩增后用G418筛选，从而获得纯化的胰岛。参考文献 1 Dochertyand development of theislets of Langerhans:implica tions for thetreatment of diabetes Opinionin Pharmacol。 gy, 20XX, 1:641-650.2Ferber S , Halkin , Cohen H, et and duodenal homeobox gene1in duce expression if insulin genes in liver and ameliorates

22、 strepto otoc ininduced , 20XX, 6:568-572.3 Mckinnon CM Docherty duodenal homeobox1PDX1 a- majorregulator of 0 cell function and , 20XX, 44:1203-1214.4Dutta S , Gannon M Peers B , et :PBX plexe sare required for normal proliferation of pancreatic cells during , 20XX, 98 (3) :1065-1070.5Gu G, Dubausk

23、aite J , Melton D evidence for the pancreatic lin eage:NGN3+cells are islet progenitors and are distinct from duct pro - , 20XX 129:2447-2457.6 Docherty and development of the isletsof Langerhans:implica tions for the treatment of diabetes Opinionin Pharmacolo - gy, 20XX, 1:641-650.7 Lee JC, SmithSB

24、, WatadaH et ulationof the pancreaticpro en - docrine gene , 20XX 0:928936.8 Gasa R,Mrejen C , Leachman N et genes coordinate the pancreatic islet differentiation program in Natl Acad Sci U S A, 20XX, 7101(36) :13245-13250.9 Mellitzer G, Martin M, Sidhoum-Jenny M, et isletpro genitor cells in Neurog

25、enin3-YFP knock-add- on En _ docrinol , 20XX 5.10 Leon-Quinto T , Jones J , Skoudy A, et vitro directeddifferenti ation of mouse embryonic stem cells into insulin- producing - betologia , 20XX, 29.11 GuoY, Costa R, RamseyH,et embryonic stem cell transcription factors Oct-4and FoxD3interact to regula

26、te endodermal-sp ecific pro moter Natl Acad Sci USA , 20XX 99:3663-3667.12 Chiang MK Melton transcript analysis of pancreas ,20XX, 4 (3):383-3.13 pancreatic stem cells can reverse diabetesin ,20XX, 320 (3) :736.14 G nterK , differentiation and growth of theendocrine pan - Arch , 20XX 436:527-538.15

27、Peters J , Jurgensen A ,Kloppel , differentiation and growth of the endocrine Arch, 20XX,436:527-538.16 Rachdi L , Ghazi LE , Bernex F , et of the receptortyrosine kinase KIT in mature cells and in the pancreas in betes , 20XX 50 (9) :2021-2028.17 Schwitzgebel VM ScheelDW； Conners J R, et ofneuro ge

28、nin3reveals an islet cell precurs or population in the opment, 20XX, 127:3533-3542.18 Gradwohl G, Dierich A, LeMeurM, et requiredfor the development of the four endocrine cell lineages of the Natl Acad Sci USA, 20XX, 97:1607-1611.19 Schmied BM, Liu GZ , Matsuzaki H, etof islet cells in long , 20XX,

29、20 (4) :337-347.20 Matthews KA, RhotenWB Driscoll HK , et A deficiency impairs fetal islet development and causes subsequent glucose intolerance in adult Nutr, 20XX 134(8) :1958-1963.21 ChenY, ChongMM Darwiche R, et pancreatitis withex ocrine destruction and increased islet neogenesis in mice with suppressor of cytokine J Pathol , 20XX, 165 (3) :913-921.22 GesinaE, Tronche F, Herrera P, et the role of glucocorti _ coids on pancreas , 2