药物分析第十六章抗生素类药物分析

1、药物分析第十六章抗生素类药物分析概 述1-内酰胺类2氨基糖苷类3四环素类4高分子杂质检查5在低微浓度下即可对某些生物在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称制作用的化学物质的总称喹诺酮类喹诺酮类林可霉素类林可霉素类氨基糖苷类氨基糖苷类酮康唑酮康唑环丝氨酸环丝氨酸利福平利福平红霉素红霉素制霉菌素制霉菌素杆菌肽杆菌肽甲氧苄胺嘧啶甲氧苄胺嘧啶四环素类四环素类两性霉素两性霉素B万古霉素万古霉素磺胺药磺胺药氯霉素氯霉素多粘菌素类多粘菌素类-内酰胺类内酰胺类核酸合成核酸合成细胞蛋白合成细胞蛋白合成细胞膜渗透性细胞膜渗透性细胞壁细胞壁产

2、品稳定性差产品稳定性差分子结构大多不稳定，降解分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒后疗效下降、失效或增加毒副作用副作用发酵过程不易控制易受污染发酵过程不易控制易受污染生产工艺复杂生产工艺复杂发酵液中杂质发酵液中杂质 无机盐、脂肪、各种蛋白质、无机盐、脂肪、各种蛋白质、各种降解产物、色素、热原、各种降解产物、色素、热原、毒性物质毒性物质 鉴别：鉴别：理化方法理化方法( (主要方法主要方法) )、微生物法、微生物法官能团的显色反应，如：官能团的显色反应，如：-内酰胺环的羟肟酸铁反应；内酰胺环的羟肟酸铁反应；链霉素的麦芽酚反应、坂口反应；链霉素的麦芽酚反应、坂口反应；光谱法：红外光谱及紫

3、外吸收光谱的鉴别。光谱法：红外光谱及紫外吸收光谱的鉴别。色谱法：色谱法：HPLCHPLC和和TLCTLC法，采用标准品对照品对照法；法，采用标准品对照品对照法；生物学法：比较抑菌能力，现已少用。生物学法：比较抑菌能力，现已少用。 检查：检查：影响产品稳定性的检查项目：结晶性、酸碱度、水分影响产品稳定性的检查项目：结晶性、酸碱度、水分或者干燥失重等或者干燥失重等控制有机和无机杂质的项目：溶液澄清度与颜色、有控制有机和无机杂质的项目：溶液澄清度与颜色、有关物质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属等；关物质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属等；与临床安全性有关的检查项目：异常毒性、热源或细与临床安全性有关的检查项

4、目：异常毒性、热源或细菌内毒素、降压物质、无菌等菌内毒素、降压物质、无菌等含量/效价测定： 微生物法：与临床疗效吻合与临床疗效吻合, ,灵敏度高，结果直观，灵敏度高，结果直观，适用范围广；但操作复杂费时，误差大适用范围广；但操作复杂费时，误差大 理化方法：准确度与专属性较高准确度与专属性较高, , 且操作简便；但且操作简便；但与临床疗效有偏差与临床疗效有偏差NSCH3CH3COOHOHN1234567RCO母核（6-氨基青霉烷酸）6-aminopenicillanic acid简称简称6-APA青霉素类7654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）RCO7-aminoce

5、phalosporanic acid,简称7-ACA头孢菌素类氢化噻唑环氢化噻唑环氢化噻嗪环氢化噻嗪环CONSOHNCOOHCH3CH3CH2 青霉素青霉素(苄青霉素苄青霉素) (penicillins)CHCOHNNH2NSCH3CH3COOHO氨苄西林氨苄西林CHCOHNNH2HONSCH3CH3COOHO阿莫西林阿莫西林CHCOHNNH2CH3NOSCOOH头孢氨苄头孢氨苄CH3NOSCOOHCHCOHNNH2头孢拉定头孢拉定CH3NOSCOOHCHCOHNNH2HO头孢羟氨苄头孢羟氨苄SCH2CONONHSCH2OCOCH3COONa头孢噻吩钠头孢噻吩钠1.酸性（羧基）酸性（羧基） ，

6、酸性较强。碱金属盐水溶性好，有机碱盐，酸性较强。碱金属盐水溶性好，有机碱盐难溶于水。难溶于水。2.手性手性C （旋光性）（旋光性）NSO1234567NOS12345678青霉素类：苯环取代基头孢菌素类：母核有共轭结构260nm4. 内酰胺环内酰胺环(四元环张力+酰胺键 ) 干燥条件较稳定，溶液不稳定干燥条件较稳定，溶液不稳定失失效效降降解解青青霉霉素素类类酸酸、碱碱、青青霉霉素素酶酶某些氧化剂、金属离子、温度某些氧化剂、金属离子、温度失失效效降降解解头头孢孢菌菌素素类类酸酸、碱碱、胺胺类类内内酰酰胺胺酶酶 ( (一一) )色谱法色谱法HPLC (tR)TLC (Rf)(二)光谱法IR UVN

7、MRNH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH2(三)呈色反应1 1）羟肟酸铁反应）羟肟酸铁反应内酰胺环内酰胺环内酰胺类NH2OHHClNaOH羟肟酸 Fe3+ H+显色（红、棕、褐）2 2）类似肽键（）类似肽键（-CONH-CONH-）a.a.茚三酮反应茚三酮反应-氨基氨基 CNH2H+OOHOHOCOHONCOO+CO2+3H2Ob.b.双缩脲反应双缩脲反应内酰胺类内酰胺类 碱性酒石酸铜紫色2OHCONH2CuCOHNCCH3COONaCH3SNHNCH3CH3COONaCSNOHOHOOCH2NH2CH2HH3 3）其他呈色反应）其他呈色反应橙黄色橙黄色重氮苯磺酸重氮苯磺酸 OHH

8、C56（偶合）呈暗黄色氨苄西林水浴加热甲醛硫酸水湿润-青霉素钾和青霉素钠呈红棕色(四)各种盐的反应焰色反应K+、Na+(聚合物、有关物质、异构体等)1.聚合物头孢他啶中聚合物测定头孢他啶中聚合物测定分子排阻色谱分子排阻色谱凝胶色谱分子筛机制凝胶色谱分子筛机制 主成分自身对照法主成分自身对照法 面积归一化法面积归一化法 限量法限量法 自身对照外标法自身对照外标法OOOHOOHCH2OOOHOOHCH2OOOHOOHCH2OOOHOOHCH2OOHOOHCH2OOCH3OHOHOOOCH2OHHOOOOHOHOOH2COOOOOHHOH2COOH2COHHOOCH2OOOH2COOHHOOOOOH

9、OOHCH2OOCH2OHHOOOOOCH2OHHOOOOCH2OHHOOOOH2COHHOOOOCH2OHHOOOOOOHOHOH2COOH2COHOCH2OHHOOOH2COCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHHCOHCH2CH2CH2HCOH 萄聚糖凝胶萄聚糖凝胶立体网状结构图立体网状结构图2.有关物质与异构体有关物质与异构体头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查 取本品适量，精密称定，加流动相制成约含的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加流动相制成2.5 g/ml的溶液，作为对照溶液。

10、取对照溶液20l注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10%，再取供试品溶液和对照品溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的倍，供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和，其中E异构体峰面积不得大于对照溶液主峰面积之和(1.0%)，3-异构体峰面积不得大于倍(1.5%)，其余单个杂质峰面积的和不得大于3倍(3.0%)。(供试品溶液中任何小于对照品溶液主峰面积之和倍的峰可忽略不计) 青霉素钠青霉素钠(钾钾)的吸光度检查：的吸光度检查： 本品加水制成每本品加水制成每1mL含有含有1.80mg的溶液，照的溶液，照UV-Vis法，在法，在280nm波长处测定

11、吸光度，不得大于波长处测定吸光度，不得大于0.10；在；在264nm波长处有最大吸收，吸光度应为波长处有最大吸收，吸光度应为0.80-0.88. 该法该法264nm处吸收值用来控制青霉素钠处吸收值用来控制青霉素钠(钾钾)的含量，的含量，280nm处吸收值用来控制杂质的含量。处吸收值用来控制杂质的含量。4.有机溶剂：用GC法或者HPLC法5.结晶性第一法(偏光显微镜法)第二法(X射线粉末衍射法)u 碘量法u 汞量法u 酸碱滴定法u 羟肟酸比色法u HPLC法阿莫西林克拉维酸钾片色谱条件与系统适用性试验色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠，加水90

12、0 ml溶解，用磷酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至，加水稀释至1000ml)-甲醇(95:5)为流动相；流速为；检测波长为220nm。阿莫西林峰与克拉维酸峰的分离度应大于 测定法 取本品10片，置1000ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林和克拉维酸的混合溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算供试品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。 碱性环己多元醇碱性环己多元醇+ +氨

13、基糖氨基糖苷苷链霉素链霉素(Streptomycin)巴龙霉素巴龙霉素(paromomycin)OCH2OHHOOHNH2OOHNH2H2NOOHOOOR2OHHOH2NCH2OHR1D-D-葡萄糖胺葡萄糖胺脱氧链霉胺脱氧链霉胺巴龙胺巴龙胺D核糖核糖巴龙霉糖巴龙霉糖巴龙二糖胺巴龙二糖胺庆大霉素庆大霉素(Gentamycin)1 1）溶解度（氨基、羟基）：水溶性）溶解度（氨基、羟基）：水溶性2 2）碱性（氨基）：临床应用其硫酸盐；溶于水，）碱性（氨基）：临床应用其硫酸盐；溶于水，但不溶于有机溶剂；但不溶于有机溶剂；3 3）旋光性（糖）：多个手性碳）旋光性（糖）：多个手性碳4 4）稳定性（苷）：强

14、酸、碱条件均可水解；临）稳定性（苷）：强酸、碱条件均可水解；临床使用时对床使用时对pHpH值有很高的要求；值有很高的要求；5 5）紫外吸收光谱）紫外吸收光谱1. 1.茚三酮反应茚三酮反应羟基胺类羟基胺类,-,-氨基酸氨基酸蓝蓝紫紫色色庆庆大大霉霉素素链链霉霉素素茚茚三三酮酮2. Molisch 试验 五碳糖或六碳糖结构OHOH2CCHOOHOHOH2CCHOHOH红紫色羟甲基糠醛( (含六碳糖结构氨基糖含六碳糖结构氨基糖苷类酸性水解产物苷类酸性水解产物) )OHOH2CCHOoOH2CCHoo蓝紫色3. N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）甲甲基基葡葡萄萄糖糖胺胺庆庆大大霉霉素

15、素链链霉霉素素水水解解 N乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+红色4.麦芽酚反应链霉糖特有反应紫红色麦芽酚链霉糖链霉素分子重排3OHFeH+NH C NH2HOOHOHNHCH2NOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHNHNHCH3H2O NaOHOOOHCH3OOCH3Fe3+H+OFe33+/紫红紫红麦芽酚麦芽酚5.坂口反应链霉胍特有反应橙橙红红羟羟基基喹喹啉啉链链霉霉胍胍链链霉霉素素次次溴溴酸酸钠钠 8OH（或或-萘酚萘酚）NH CNHNH2HOOHOHNHCH2NNHOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHCH3坂口反应麦芽酚反应N-甲基葡萄糖胺反应6.硫酸盐反应

16、7.色谱法：TLC和HPLC法8.光谱法：IR、UV1.链霉素中链霉素B（甘露糖链霉素）的检查来源：发酵中产生方法：TLC中的对照品法2.硫酸奈替米星中西索米星的检查(TLC)3.庆大霉素C组分的测定微生物检定法微生物检定法平行反应，检测同等量下供试品和对照品对微生物的抑平行反应，检测同等量下供试品和对照品对微生物的抑制作用；制作用；管碟法：利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较管碟法：利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品和供试品对菌群产生的抑菌圈大小；标准品和供试品对菌群产生的抑菌圈大小；浊度法：通过抗生素在液体培养基中对细菌生长的抑制浊度法：通过抗生素在液体培养基中对细菌生长的

17、抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品和供试品抑菌程度，测定供试品效价；和供试品抑菌程度，测定供试品效价；-该法优点：灵敏度高、量少、直观；与临床要求一直；该法优点：灵敏度高、量少、直观；与临床要求一直；使用范围广；是效价测定的最基本方法；目前分子结构使用范围广；是效价测定的最基本方法；目前分子结构复杂、多组分抗生素，首选该法测效价。复杂、多组分抗生素，首选该法测效价。-该法缺陷：操作步骤多，时间长，误差大。该法缺陷：操作步骤多，时间长，误差大。HPLC法法有紫外吸收有紫外吸收紫外、荧光检测器紫外、荧光检测器无紫外吸收无紫外吸收衍生

18、化；衍生化； 电化学检测器或蒸发光散射法电化学检测器或蒸发光散射法2CH3NRR3HOHCONH2OOHOHOOHR2R1ABCD1234567891011121）两性：）两性： -OH酸性酸性 N(CH3)2碱性碱性 Ca2+、Mg2+生成不溶性盐；生成不溶性盐；Fe3+形成红色配合物；形成红色配合物； Al3+形成黄色配合物形成黄色配合物 ；pH3 7.5 多价阳离子与酚二酮多价阳离子与酚二酮荧光荧光 l 与酸、碱均可成盐；l 临床多用盐酸盐；l 强酸或强碱中溶解度 2）旋光性）旋光性3）与金属离子络合）与金属离子络合(酚羟基、烯醇基酚羟基、烯醇基)4）UV和荧光和荧光 弱酸性（弱酸性（p

19、H2-6） A环环C-4异构化异构化 差向四环素差向四环素酸性（酸性（pH 2） C环脱水环脱水 脱水四环素脱水四环素碱性碱性 C环开环，形成内酯环开环，形成内酯 异四环素异四环素5）不稳定性A.A.差向异构化差向异构化差差向向金金霉霉素素差差向向四四环环素素金金霉霉素素四四环环素素 4462pH蓝色荧光淡黄黑OOHCONH2(CH3)2NOHHOOHCONH2N(CH3)2HOHAApH2.06.02CH3NHOHCONH2OOHOHOOHR2R1HO（氢键，土霉素、多西环素不易差向异构化）B.B.酸性脱水降解酸性脱水降解脱脱水水金金霉霉素素脱脱水水四四环环素素金金霉霉素素四四环环素素 2pHmax = 445nmmax = 435nmROHCH3OHOOHHRCH3OHOOHRCH3OHOHOH2ODDDCBBCBCC.C.碱性脱水降解碱性脱水降解)(无活性无活性异四环素异四环素四环素四环素 OHROHCH3OHROOHOOHCONH2NHOHCH3CH3CH3CH3ROHROOOHCONH2NHOH