HSCT细胞培养及鉴定试验报告

1、HSC-T6大鼠肝星状细胞培养及鉴定实验报告前言肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)的名称有多种多样，如肝贮脂细胞(fat-storingcell,FSC)、脂细胞(lipocyte)、维生素A贮存细胞(vitaminA-storingcell)、窦周细胞(perisinusoidalcell)、Ito细胞等。HSC&于Disse间隙内，紧贴着肝窦内皮细胞(sinusoidalendothelialcells,SEC)和肝细胞。其形态不规则，胞体呈圆形或不规则形，常伸出数个星状胞突包绕着肝血窦。止匕外，HSC还伸出胞突与肝细胞、邻近的星状细胞相接触。HSCB质内

2、有114个直径约1.02.0的富含维生素A和甘油三酯的脂滴，胞浆中有丰富的游离核糖体、粗面内质网及发达的高尔基复合体。胞核形态不规则，由于脂滴的挤压，常致细胞核有一个或多个凹陷，核内可见12个核仁。正常肝脏中HSC勺数目很少，只占肝细胞总体数目的5%8加总体体积的1.4%,但HSC勺立体分布和伸展足以覆盖整个肝窦微循环。正常情况下HSCft现为富含VitaminA脂滴的静止型，其功能主要有：(1)代谢和贮存VitaminA：肝脏储存有体内80流右的名t生素A,对体内维生素A的代谢起着重要作用。视黄醛在小肠内酯化后被运输到肝脏并与特异的视黄醛结合蛋白结合，然后转运到邻近的HSCt存。(2)储存脂

3、肪：正常HSO质内的脂滴含有大量的甘油三酯，为肝细胞提供能源。(3)合成和分泌胶原及糖蛋白、蛋白多糖等基质成分。目前的研究认为，HSO正常及纤维化肝脏中细胞外基质(extracellularmatrix维化肝脏中细胞外基质(extracellularmatrix,ECM的主要合成细胞。正常肝脏中HSC10倍、内皮细胞的20倍以上10倍、内皮细胞的20倍以上合成的胶原以I型、m和IV型为主，其合成量是肝细胞的HSC还能合成纤维连接蛋白、层连蛋白和粗纤维调理素等糖蛋白成分，以及硫酸皮素、硫酸软骨素和透明质酸等蛋白多糖。(4)合成基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP

4、)及其组织抑制剂(tissueinhibitorofmetalloproteinase,TIMP):正常情况下，HSCfg分泌多种胶原酶和基质降解蛋白酶如基质金属蛋白酶MMP-1MMP-将以降解各种细胞外基质，同时分泌组织金属蛋白酶抑制剂TIMP-1防止胶原过度降解，使肝脏ECM勺合成和分解处在一个动态平衡中。(5)表达细胞因子及受体：正常情况下，HSCM以分泌肝细月fi生长因子(HGF,参与肝细胞再生的调控。此外，HSCZE能表达少量的转化生长因子(transforminggrowthfactor-0,TGF-0)、血小板衍生的生长因子(Plateletderivedgrowthfactor

5、,PDGF和胰岛素样生长因子(IGF)等，同时HSCfg表达TGF-B1的II、III型受体和PDG改体的a亚单位等。(6)参与肝窦血流调节：HSCf中出胞突包绕着肝窦，通过其纤长突起的收缩功能调节肝窦内微循环，从而影响着肝脏的血流分布和门静脉压力。一、材料与方法.实验材料1.1 实验材料大鼠肝星X尤细胞株HSC-T6®自与中国科学院上海细胞所。1.2 主要仪器CO细胞培养箱：上海力康仪器有限公司SmartCellHF-90生物安全柜：上海力康仪器有限公司HF1200LC台式高速冷冻离心机：上海力康仪器有限公司Neofuge15R台式低速离心机：上海飞鸽仪器有限公司TGL-16GB荧

6、光倒置显微镜：日本尼康公司EclipseTS100-F显微镜：日本尼康公司E200病理图文分析系统（工作站）：上海千屏公司恒温水浴锅：上海精宏仪器厂DK-80液氮罐：成都金凤仪器厂YDS-50-125-20C低温冰箱：合肥美菱公司DW-HL388单子分析天平（0.01mg）:德国梅特勒AB304-S手动单道移液器：彳惠国Eppendorf公司Researchplus1.3主要试剂名称货号/批号厂家PB瞬酸盐缓冲液粉剂PBS0060,Lot#福州迈新生物技术开发有限公司胎牛血清DMEM养基0.25%tt酶青霉素-链霉素双抗(10000LD小鼠抗a-SMAB克隆抗体小鼠两步法免疫组化试剂盒SC30

7、010Lot#J130071KIT9902,Lot#1301319902浓缩型DABC剂盒DAB0031Lot#1FITC标记山羊抗小鼠二抗油红球色试剂盒D027苏木素染液油酸美国Lifetechnologies公司美国Lifetechnologies公司美国Lifetechnologies公司美国Hyclone公司美国SantaCruz公司福州迈新生物技术开发有限公司福州迈新生物技术开发有限公司北京中衫金桥有限公司南京建成生物工程有限公司福州迈新生物技术开发有限公司西安化学试剂厂中性树胶中国上海标本模型厂2.实验方法2.1 试剂配制及抗体稀释10%1清完全培养基：10ml的胎牛血清加入90m

8、l的DME叶养基中，添加1ml的青-链霉素双抗溶液。0.2mM的油酸完全培养基：1ml的20mM勺油酸加入99ml的完全培养基中。a-SMA抗体工彳液：a-SM-抗（200仙g/ml）取20仙l加入到980仙l的PBS中。FITC标记的山羊抗小鼠二抗工作液：FITC标记的山羊抗小鼠二抗（200仙g/ml）取20/力口入至IJ980仙l的PBS中。20%DMSO胞冻存液：2ml的DMS鲂液力口入8ml的完全培养基中。油红O染液：油红O储存液与双蒸水以3:2的比例混合，并用滤纸进行过滤，使用前2h内配制。2.2 HSC-T6细胞培养基本操作方法细胞传代：观察培养瓶（25cm）中细胞贴壁融合达90%

9、寸，即可进行细胞的传代，操作步骤如下。开启生物安全柜紫外消毒30min,以75%L醇擦拭台面灭菌，并预先准备3个细胞培养瓶（25cm）、15ml离心管、无菌过滤的PBS0.25%K酶溶液、完全培养基，取出长满细胞的培养瓶，倒空瓶中的培养基，加入2ml过滤灭菌的PBS®冲液反复冲洗2遍，倒空PBS缓冲液，每瓶中加入1ml的0.25%的胰酶溶液，使胰酶溶液平铺在细胞层面上，缓缓摇动细胞培养瓶，待细胞70%兑落时加入1ml的完全培养基终止胰酶的消化作用，并用吸头反复冲洗培养瓶底将未脱落的细胞冲洗下来，转移液体至15ml的离心管中，1800r/min离心5min,小心吸弃离心管中的液体，并用

10、1ml的完全培养基重悬沉淀的细胞，倒置显微镜下观察细胞调整合适的细胞密度接种到培养瓶中，37C,饱和湿度，5%CG田胞培养箱中培养,6h后持续观察细胞贴壁状态，待细胞达到50%70%!占壁融合时倒空瓶中培养基，重新加入5ml的含0.2mMz由酸的完全培养基，继续培养。细胞冻存：消化、离心、重悬步骤同细胞传代，取1ml的细胞重悬液，加入1ml的20%DMSO的细胞冻存液颠倒混匀，并移至2ml的冻存管中，冻存管中细胞经4c(20min)、-20c(20min)的程序降温后，转移至液氮中冻存。细胞复苏：从液氮中取出冻存的细胞，立刻置于37c水浴中快速晃动冻存管使细胞快速解冻，倒置显微镜下观察细胞密度

11、并接种到培养瓶中，37C、饱和湿度、5%COffl胞培养箱中培养。2.3 HSC-T6细胞a-SMA免疫组化染色细胞接种于直径33mm勺细胞培养皿中,待细胞达到50%!占壁融合时，进行a-SMA免疫组化实验，步骤如下：2.3.1 细胞固定：培养皿中加入1ml1:1的冷的丙酮和甲醇，置于-20C进行细胞固定，20min后弃固定液，用PBS反复漂洗3遍，每次5min。培养皿中加入1ml的0.2%曲拉通100溶液，室温放置20min后弃去通透液，PBS反复漂洗3遍，每次5min用免疫组化笔在培养皿中划圈，并在圈中滴加山羊血清50L37c孵育20min,然后取出PBS®洗3次，每次5min。

12、2.3.4 一抗孵育培养皿中滴加稀释后的小鼠抗a-SMA单克隆抗体50L,4c孵育过夜，经过夜孵育后取出用PBS®洗3次，每次5min。2.3.5 二抗孵育培养皿中滴加Elivision试剂盒中的增强剂1滴（大约50仙L）,并于室温孵育20min,PBS漂洗3次，每次3min,然后每张组织切片滴加Elivision试剂盒中的二抗1滴（大约50L）,37c孵育30min,PBSS洗3次，每次3min。2.3.6 DAB显色培养皿中滴加新鲜配制的DAB容750L,室温孵育10min,显微镜下观察有细胞中有明显的棕黄色颗粒状沉淀时，立刻将组织切片放入自来水中漂洗以终止反应。2.3.7 苏木

13、素复染苏木素复染3min,自来水冲洗使培养皿中的细胞核返蓝。2.3.8 封片培养皿中滴加甘油，并以盖玻片封片。2.3.9 观察拍片在正置光学显微镜下观察HSC-T6细胞胞浆中alpha平滑肌激动蛋白染色，并于40倍、100倍、200倍下拍照。2.4 HSC-T6细胞a-SMAffl胞免疫荧光细胞接种于直径33mmi勺细胞培养皿中,待细胞达到50%!占壁融合时，进行a-SMAffl胞免疫荧光实验，步骤如下：2.4.1 细胞固定：培养皿中加入1ml1:1的冷的丙酮和异丙醇，置于-20C进行细胞固定，20min后弃固定液，用PBS反复漂洗3遍，每次5min。2.4.2 细胞通透化：培养皿中加入1ml

14、的0.2%曲拉通100溶液，室温放置20min后弃去通透液，PBS反复漂洗3遍，每次5min。2.4.3 封闭用免疫组化笔在培养皿中划圈，并在圈中滴加山羊血清50L37c孵育20min,然后取出PBSS洗3次，每次5min。2.4.4 一抗孵育培养皿中滴加稀释后的小鼠抗a-SMA单克隆抗体50L,4c孵育过夜，经过夜孵育后取出用PBS®洗3次，每次5min。培养皿中滴加50L稀释后的FITC标记的山羊抗小鼠IgG二抗，37c孵育1h,PBSS洗3次，每次5min。2.4.6 观察拍片设置荧光倒置显微镜激发波长为488nm观察细胞alpha-平滑肌肌动蛋白荧光显色，并在100倍、200

15、倍、400倍视野下拍照。2.5 HSC-T6细胞油红。染色细胞接种于直径33mm勺细胞培养皿中，并以含0.2mM油酸的完全培养基进行干预，使细胞富集脂肪滴，细胞待细胞达到50加占壁融合时，进行油红。染色实验，步骤如下：2.5.1 细胞固定：培养皿中加入4%；聚甲醛溶液，室温固定30min,弃固定液，用PBS反复漂洗3遍，每次5min。2.5.2 油红O染色：培养皿中加入1ml新鲜配制的油红O染液，室温放置10min后弃去染液，PBS反复漂洗3遍，每次5min。2.5.3 苏木素复染培养皿中加入1ml苏木素染液室温染色30s,弃去苏木素染液，以双蒸水漂洗3遍，每次5min,加入1ml的自来水反蓝

16、。培养皿中滴加一滴甘油并以盖玻片封片。2.5.5 观察拍片正置光学显微镜下观察肝星状细胞胞浆中红色脂肪滴染色，并在100倍、200倍、400倍视野下拍照。2.6 HSC-T6细胞VitaminA脂滴荧光观察设置荧光倒置显微镜激发波长为328nm观察培养的HSC-T6细胞胞浆中VitaminA脂滴荧光。二、结果与分析.HSC-T6细胞培养传代的形态学特征基本情况HSC-T6细胞株培养5-8代时能观察到细胞较大，呈多边形、多核，且胞浆富含脂滴及VitaminA形态（见图1）,8代以后继续培养HSC-T6细胞表现为肌成纤维样细胞的形态学特征，即HSC-T6贴壁后即开始伸展，胞体增大呈不规则的多边形，

17、并伸出许多伪足与其他HSC-T6细胞相连形成片状（见图2）。HSC-T6细胞大量增殖，细胞密度变大后，细胞形态变小，略呈梭形的多边形，且有伪足与相邻细胞相连，在培养表面均匀的分布（见图3）。AD图15-8代HSC-T6细胞形态特征A、B:荧光倒置显微镜下，HSC-T能态，100X；B、C:荧光倒置显微镜下，HSC-T6形态，200X（箭头所标示处为多核的HSC-T6细胞）ABCD图28代后HSC-T6细胞形态特征AB:荧光倒置显微镜下，HSC-T6B态，100X；B、C:荧光倒置显微镜下，HSC-T6形态，200X（箭头所标示处为多核的HSC-T6细胞）ABCD图3HSC-T6细胞密度加大时形

18、态特征A、B:荧光倒置显微镜下，HSC-T6B态，100X；B、C:荧光倒置显微镜下，HSC-T6形态，200X1 .HSC-T6细胞鉴定HSC-T6细胞脂肪滴油红O染色含0.2mM的油酸的完全培养基使HSC-T6细胞富集脂滴，并用油红O染液染色，光学正4)4)置显微镜下观察胞核呈蓝色，胞浆中有点状红色，为脂滴着色（见图图4HSC-T6M胞月旨滴的油红O染色400X1.1 HSC-T6细胞VitaminA脂滴紫外激发的自发荧光HSC-T6细胞中的脂滴在328nm紫外波长的激发光下发出极易淬灭的蓝绿色荧光（见图5）。图5HSC-T6细月fiVitaminA脂7g328nm紫外激发荧光200XA、B：暗场VitaminA脂滴荧光；C、D叠加场VitaminA脂滴荧光HSC-T6细胞a-SMA免疫组化HSC-T6细胞株为激活的肝星状细胞，细胞爬片显示HSC-T6细胞胞浆均可见棕黄色颗粒状沉淀，alpha-平滑肌肌动蛋白免疫组化染色为阳性