青枯菌无致病力菌株对烟草青枯病的控病作用初步研究_图文

1、的 , 不是在实验室侵染所致 。 经初步试验观察 , 分生孢子在老叶上虽然能较好地萌发 , 但不能形成附着 胞 , 所以 , 不能侵染老叶 , 茶园中老叶上的病斑一般 都是由成叶上病斑遗留下来的 。 3. 3 综合治理根据试验结果和病原菌的生物学特性 1, 8, 结 合当前的无公害茶叶生产考虑 , 对于该病的防治应 采用控制病原菌为主的措施 。 最好在深秋除去茶树 老叶中的病叶 , 并清理茶园中的落叶 , 旨在控制越冬 菌源 。 春季的定期采摘对控制该病的流行具有明显 的作用 。 病害特别严重的茶园可在深秋封园时 , 在 采用上述措施的基础上 , 每隔 23年喷 1次石硫合 剂或波尔多液 9。

2、参考文献1 陈宗懋 , 陈雪芬 . 茶树病害的诊断和防治 M .上海 :上海科技出版社 ,1990.2 安徽农学院 . 茶树病虫害 M .北京 :农业出版社 ,1993. 3 高旭晖 . 茶树病害研究法 J.茶业通报 , 1993(2 :26228. 4 方中达 . 植病研究法 M .北京 :中国农业出版社 ,1997. 5 Matosupono M. Some factors influenced t he tea resistance toblister blight C Proceedings of t he International Symposium on Tea Science.

3、 1991,Shizouka , J apan :The Organizing Com 2mittee of ISTS , 1992:6512654.6 Bajit G B. Relationship between morphological characteristicsand varietal resistance of sweet potato to scab infection caused by S p haceloma batatas J.Annals of Tropical Research , 1987(9 :75283.7南京 农学院 . 田间试验 和统计方 法 M .北

4、京 :农 业 出 版社 ,1979.8 谭济才 , 叶恭银 , 高旭晖 , 等 . 茶树病虫防治学 M .北京 :中国农业出版社 ,2002.9 陈雪芬 , 陈宗懋 . 茶园农药应用技术 M .北京 :化学工业出版社 ,2001.收稿日期 : 2007208201 修订日期 : 2007210212基金项目 : 重庆市烟草公司资助项目 3通讯作者 E 2mail :chgxiao . cn青 枯 菌 无 致 病 枯 病 的研 究1, 肖崇刚 13, 邹 阳 2, 袁希雷 1(1. 西南大学植物保护学院 , 重庆 400716; 2. 云南省楚雄州烟草公司武定县分公司 651600

5、摘要 从茄子 、 番茄 、 辣椒 、 烟草青枯病株中分离出 116株无致病力青枯菌 , 室内平板喷雾法拮抗试验结果表明 , 有21株菌在 NA 培养基上可明显抑制青枯菌 TbRs 的生长 ; 烟草 MSK326品种温室盆栽控病试验表明 , Tmjd123和 Aujd82221两株菌具有较好控病效果 ,20d 后的相对防效分别为 58. 4%和 97%。关键词 烟草 ; 青枯病菌 ; 无致病力菌株 ; 防效 中图分类号 S 435. 72; S 476. 1A preliminary study on the control of tobacco bacterial wilt by avirul

6、entstrains of Ralstonia sol a nacea r umXiao Tian 1, Xiao Chonggang 1, Z ou Yang 2, Yuan Xilei 1(1. College of Plant Protection , S outhwest Universit y , Chongqing 400716, China; 2. Chux iong Tobacco Com pany W uding B ranch , Yunnan 651600, China Abstract A total of 116avirulent strains of Ralston

7、ia solanacearum were obtained f rom the stems of eggplants , to 2matos , capsicum and tobacco that were affected by this pathogen. I n vit ro antagonistic assay by spraying indicated that 21of the strains significantly inhibited the growth of R. solanacearum TbRs on NA media. In a disease 2control e

8、xperiment with tobacco MSK326carried out in greenhouses , two isolates (Tmjd123and Aujd82221 gave satisfacto 2ry results , with 58. 4%and 97%relative control rates , respectively. K ey w ords tobacco ; Ralstonia solanacearum ; avirulent strain ; efficacy 烟草青枯病是由劳尔氏菌属的茄假单胞杆菌(R alstoni a sol anacearum

9、 引起的热带 、 亚热带地区97 研 究 报 告 第 34卷第 2期 (2008PLAN T PRO TECTION Vol. 34No. 2(2008 烟草的重要病害 , 是一种典型的维管束病害 , 一旦 发病即可造成全株死亡 , 对烟草的产量和质量影响 极大 , 是烟草上一大毁灭性病害 1。目前对烟草青 枯病的防治 , 仍无十分有效的措施 2。生物防治具 有无公害 、 无环境污染和防治作用专化性等优点 , Okabe 在 1954年首次发现青枯菌株之间有拮抗作 用后 , 国内外许多学者开展了利用无致病力青枯菌 防治植物青枯病的研究工作 3。 A. Trigalet 等发 现诱变产生的无致病

10、力青枯菌突变株 GM I1229能 在番茄茎 、 叶部定殖 , 可阻止致病菌的增殖 , 并表 现有一定诱导抗性 , 具有较好的生物防治前景 4。 陈庆河用紫外诱变法获得两株无致病力菌株 , 研究 发现这两株菌也能在番茄体内定殖 , 经盆栽试验表 明 ,20d 后对番茄青枯病防效可达 50%以上 5。 本文探索了从 4种茄科植物上分离得到的无致病 力青枯菌株对烟草青枯病的生防潜能 。1 材料与方法1. 1 供试材料试验烟草品种 ,提供。 指示菌 TbRs , 由本实验室提 供。 固体培养基为 NA , 致病性测定培养基为 TTC , 液 体培养基为 NB , 配方详见 植病研究方法 第 3版 6

11、。 1. 2 青枯菌的采集和分离在重庆北碚区 , 江津市 , 涪陵县等地采集番茄 、 茄 、 辣椒 、 烟草青枯病病株 。两种分离方法 , 具体参照文献 7。青枯致病菌 株和无致病力菌株的区别参照方中达的方法 6。纯 化后 , 将长出的单菌落用移植环蘸取放入盛有无菌 水 的 试 管 , 采 用 比 浊 法 使 菌 悬 液 的 浓 度 达 到 3×108cf u/mL , 加塞放于 25 条件下保存 。 1. 3 无致病力菌株的鉴定通过鞭毛染色鉴定 , 准备干净光滑无痕纹的载 玻片 , 用新鲜制备的 NA 培养基活化菌株 , 制备染 剂 ,1824h 进行鞭毛染色并镜检 12。1. 4

12、 平板筛选试验初筛 :采用喷雾法 8, 将指示菌 TbRs 涂在 NA 平 板上扩大培养 , 次日将获得的无致病力菌株接种到 NA 平板上活化 , 然后每皿接菌 34位点 ,2次重复 , 培养 6h 后 , 将已培养好的指示菌配成 3×108cfu/mL 菌悬 液 , 装入无菌的喉头喷雾器中 , 将其均匀的喷在点接了 待测菌的平板上 , 每皿喷雾约 0. 2mL ,28 培养 ,48h 后观察是否有抑菌圈形成 , 并记录观察结果。复筛 :方法与初筛相同 , 将初筛时有抑菌圈的菌 种接种到 NA 平板的中心位置 , 每个菌株 3次重复 , 方法同初筛 ,48h 后采用十字交叉法测量抑菌

13、带宽 , 并记录测量结果 。含菌培养基法 9:将复筛出的抑菌带宽 1cm 的菌株采用喷雾法与含菌培养基法进行平板筛选比 较 。 喷雾法同初筛 。 将指示菌 TbRs 及待测菌株转 移到 NA 平板上活化 , 并扩大培养 , TbRs 配成 3×108cf u/mL 的菌悬液 , 与约 45 的 NA 培养基按 1 10混合 ,1h 后在平板中心接入待测菌株 , 每个菌 株 3次重复 ,28 培养 ,48h 后测量抑菌带宽 , 方法 同复筛 , 并记录测量结果 。1. 57:NA 平 , 配成 3×108cf u/mL 菌悬液 , 3片叶龄的烟草苗从土壤中拨出 , 洗净根部土

14、 壤 , 分别浸泡在相应的菌悬液中 , 对照浸水 , 浸泡 2h , 每处理 12株 , 然后移栽到塑料钵 。 15d 后伤根 灌接活性菌株发酵液 , 浓度调整为 3×108cf u/mL , 每株苗灌 5mL ,48h 后再灌 1次 ,48h 后同法接种 指示菌 TbRs 菌悬液 , 设置 3个对照 ,C K 空 灌无菌 水 ,C K Rs 灌指示菌 , C K X 灌待测菌株发酵液 。放于 28 的温室中 , 在接种后 3d 开始观察并记录结果 。 复测 10:将初测防治效果好的菌株进行复测 。 方法与初测类似 , 烟草苗菌悬液浸根后移栽 , 每处理 10株 ,3次重复 。待烟苗

15、生长 20d 后 , 伤根灌接复 测菌株发酵液 , 每株 5mL ,5d 后再灌 1次 , 第 2次 处理 48h 后 , 同法接种指示菌 TbRs , 放于 28 的 温室中 , 出现病株后连续观察 , 并记录结果 。病情分级标准为 11:0级为无症状 ;1级为植株 开始出现萎蔫症状 , 茎部出现短条黑斑 ;2级为植物 50%的叶片萎蔫 , 茎部有较大黑斑 ;3级为烟株叶片 除顶叶 23片叶外 , 全部萎蔫 , 茎部黑斑长而宽 ;4级为全株叶片萎蔫 , 茎大部变黑 。2 结果与分析2. 1 无致病力菌株鉴定结果镜检观察结果表明 (图 1 , 试验中筛选出菌株 菌体短杆状 , 两端钝圆 , 单

16、极鞭毛 13根 , 与青枯菌 0 8 第 34卷第 2期 (2008PLAN T PRO TECTION Vol. 34No. 2(2008研 究 报 告菌体形态描述相符 。 图 1 青枯菌无致病力菌株鞭毛染色结果2. 2 无致病力菌株平板筛选结果据方中达的方法区分青枯致病菌株和无致病力 菌株 6, 从采集的 184份样本上直接分离得到菌株 138株 , 其中无致病力菌株 116株 , 致病菌株 22株 ,将无致病力菌株进行平板筛选 , 菌活性的菌株共 63株 。 抑菌带宽 >1株 , 抑菌带宽最大是 TbW1, 23为 1. 38cm , ; 0. 51cm 的菌株 12, <0

17、. 5cm 的菌株 30株如表 1。将抑菌带宽 >1cm 的菌株 Tmjd123采用喷雾法和含菌培养基两种筛选方法比较 , 结果 如图 2。 对于同一个菌株 , 采用喷雾法得到的抑菌 带宽普遍大于含菌培养基法得到的 , 只有 Tmt32221、 Tb YYk121两个菌株是例外 , 说明这两个菌株对指示菌可能具有溶菌作用 。从图 3看出 , 喷雾法中部分菌株的抑菌带宽小于 1cm , 与第 1次复筛的结 果不 一致 , 它们 是 Au00422、 Aujd522、 Tb YYk121、 TbW223、 TbW12721, 说明这些菌株的抑菌活性不稳定性 , 抑菌作用开始衰退 (图 3 。

18、图 2 青枯菌无致病力菌株平板筛选的 1. Tm00222; 2. Tm00222r ; 3. Tm22221; 4. Tm7; 5. Tm12; 6. Tmt32221;7. Tmjd123; 8. Au00421; 9. Au00422; 10. Au 2jd321; 11. Aujd522; 12. Aujd82221; 13. Aujd102221; 14. Au 2jd102222;15. Aujd112124;16. Ll124;17. L623;18. Tb YYk121;19. TbW223;20. TbW12721;21. TbW12722图 3 Tmjd123菌株对烟草青枯

19、菌的抑制作用表 1 青枯菌无致病力菌株平板筛选结果抑菌带宽度 /cm菌株数量 /株菌株名称 >121T m00222、 T m22221、 T m7、 T m12、 T mt 32221、 T mjd123、 Au00421、 Au00422、 Aujd321、 Aujd522、 Aujd82221、 Aujd102221、 Aujd102222、 Aujd112123、 Aujd112124、 Ll124、 L623、 Tb YYk121、 TbW223、 TbW12721、 TbW12722;0. 5112Tm10、 Aujd322、 Aujd523、 Aujd112122、 Ll1

20、21、 L522、 L422、 Tb YY 1、 Tb YY 7Tb YYn2、 TbW324、 Tb YYk123; <0. 530Tm00221、 Tm00622、 Tm121、 Tm8、 Tm11、 Tm13、 Tmt12221、 Tmt12223、 Tmt32121、 Tmt32122、 Tmjd12721、 Tmjd12722、 Tmjd223、 Tmjd225、 Aul22121、 Aul22122、 Aul221、 Aujd121、 Aujd122、 Aujd421、 Aujd422、 Aujd521、 Aujd62222、 Aujd1021、 Aujd1122、 Tb Y

21、Y n121、 Tb YYk12221、 Tb YY k221、 Tb YYk2222. 3 温室控病试验结果将抑菌带宽 >1cm 的菌株 (21株 进行温室控 病试验 , 在初次测定的结果中 , 测定的大部分菌株能 够推迟 7d 左右发病 , C K X 只灌接待测菌株的烟草 苗未表现异常 。测定结果如表 2。 20d 后 16株的相对防效均大于 60%, 其中 Au00421、 Aujd82221、 Tmjd123、 L623、 Tb YYk121的相对防效大于 80%,1株的相对防效为 40%60%, 只有 4株的相对防效 小于 40%。 根据菌株在 NA 培养基上的生长势及 温室

22、控病试验初测结果 , 将 Tmjd123、 Aujd82221两18 研 究 报 告 第 34卷第 2期 (2008PLAN T PRO TECTION Vol. 34No. 2(2008 个菌株进行温室控病复测 , 结果如表 3。 20d 后 Tmjd123对烟草青枯病的相对防效为 58. 4%,Au 2jd82221的为 97%。表 2 青枯菌无致病力菌株温室控病 20d 后的初测结果防效 /%菌株数量 /株编号 <404T m22221、 T m12、 TbW223、 TbW1272140601Tm00222r >6016Au00421、 Au00422、 Aujd321、

23、Aujd522、Aujd82221、 Aujd102221、 Aujd102222、 T mt 32221、 Aujd112124、 T mjd123、 T m7、 T m00222、 Ll124、 L623、 TbYYk121、 TbW12722表 3 青枯菌无致病力菌株温室控病 20d 后的复测结果 1处理发病数/株病株率/%病情 指数相对防 效 /%CK 空 0000CK Rs 30100. 050. 00Tmjd123933. 320. 858. 4Aujd82221310. 02. 597. 1 各处理供试盆栽植株均为 30株。3 讨论, 从 198株中 筛选到防效较好的 2株菌72

24、8, 本试验采用青枯菌不同寄主分离筛选对烟草青枯菌有防效的无致病力菌 株 , 从 116株中筛到 2株理想菌 , 相对比较容易获得 理想菌株 , 原因可能是来自不同寄主的无致病力菌 株 , 与原寄主在协同进化过程中 , 产生了相关物质 , 而这些物质对烟草青枯菌可能具有更强的抑制作 用 。 试验中对平板筛选出的抑菌效果较好的菌株进 行了两种平板筛选方法的比较 , 喷雾法抑菌带宽普 遍大于含菌培养基法 。究其原因 , 可能主要由于喷 雾法先接种活性菌 , 有利于抑制烟草青枯菌的活性 物质的产生和积累 , 而含菌培养基法同时接种活性 菌及烟草青枯菌 , 活性物质的产生和积累比喷雾法 相对滞后 。

25、有两个菌株的情况相反 , 说明它们对烟 草青枯菌可能还具有溶菌作用 。 通过两种方法的比 较 , 作者认为 , 喷雾法比含菌培养基法操作简便 , 快 捷 , 适用于平板筛选试验 。建议可在温室控病试验 后 , 再对最终筛选出防效较好的菌株进行含菌培养 基法等相关平板抑菌试验 , 以便为探讨活性菌株的 控病作用机制提供更多依据 。试验结果表明 , 对烟草青枯菌平板抑菌作用强 的菌株 , 温室控病效果不一定好 , TbW12721的平板 抑菌作用最强 , 但是温室控病效果不理想 , 初测 7d 后相对防效为 50%, 20d 后无防效 。 Tmjd123和 Aujd82221平板抑菌作用几乎无差别

26、 , 但是温室控病作用差异大 , 说明无致病力菌株对烟草青枯菌的平 板抑菌作用强弱与温室控病效果好坏不存在正相 关 , 这与前人研究的结果相同 7。说明无致病力菌 株对烟草青枯菌的控病作用 , 除了与菌株本身产生 的抑菌活性物质相关外 , 还与菌株是否能在寄主上 定殖 , 与致病菌位点竞争能力以及是否诱导寄主抗 性等因素相联系 。 本试验中筛选出温室控病防效较 好的菌株 , 对于其具体的控病作用机制 , 以及其他无 体外抑菌活性的菌株 , , 。1 朱贤朝 , 王彦亭 , 王智法 . 中国烟草病虫害防治手册 M .北京 :中国农业出版社 ,2003.2 孔凡玉 . 烟草青枯病的综合防治 J.烟草科技 ,2003,