芹菜素通过NF-κB和MAPK抑制脂多糖诱导的

1、第3期孙亚赛, 等: 芹菜素通过NF-B和MAPK抑制脂多糖诱导的骨髓来源的巨噬细胞炎性7芹菜素通过NF-B和MAPK抑制脂多糖诱导的骨髓来源的巨噬细胞炎性孙亚赛1, 贺 云1, 刘 健2, 屈 玮2*(1. 合肥工业大学食品科学与工程学院, 合肥 230009; 2. 合肥工业大学生物与医学工程学院, 合肥 230009)摘 要: 目的 研究芹菜素在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的骨髓来源的巨噬细胞(bone-marrow- derived macrophages, BMDMs)炎性的作用。方法 用MTT方法筛选出芹菜素起作用的浓度范围。选择适当的芹菜素浓度处理

2、BMDMs, 用实时定量PCR方法检测炎性基因的表达, 用Western-blot方法检测炎性信号通路蛋白的表达, 以及荧光免疫检验法考察NF-B P65蛋白的核转位。结果 芹菜素的有效作用浓度范围为030 mol/L, 选用10, 30 mol/L浓度的芹菜素培养BMDMs后, 炎性因子的mRNA水平明显降低, 巨噬细胞从促炎性M1型向抗炎性M2型转化, 并且呈现剂量依赖的趋势。NF-B和MAPK信号通路的激活也受到了明显的抑制。结论 芹菜素能通过抑制NF-B和MAPK信号通路降低LPS诱导的BMDMs的炎性。关键词: 芹菜素; 骨髓来源的巨噬细胞; 脂多糖; NF-B; MAPKInhib

3、ition of apigenin on lipopolysaccharide-induced bone-marrow-derived macrophages inflammation through NF-B and MAPKSUN Ya-Sai1, HE Yun1, LIU Jian2, QU Wei2*(1. School of Food Science and Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China;2. School of Biological and Medical Engineering,

4、Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)ABSTRACT: Objective To investigate the effect of apigenin on lipopolysaccharide (LPS) induced inflammation and in bone-marrow-derived macrophages (BMDMs). Methods The apigenin dosage range that did not influence cell viability was detected by MTT a

5、ssay. After choosing the suitable dose of apigenin to co-culture with BMDMs, the inflammatory genes expression was detected by RT-PCR, proteins expression which participated in inflammatory signaling pathways was detected by Western-blot, and NF-B P65 nuclear translocation was investigated by immuno

6、fluorescence. Results The effective dose of apigenin was between 030 mol/L. By choosing 10 and 30 mol/L apigenin to co-culture with BMDMs, inflammatory cytokines were reduced in mRNA level, BMDMs transformed from M1 inflammatory macrophages to anti-inflammatory M2 macrophages and all these results s

7、howed in a dose-dependent manner. Apigenin also inhibited NF-B and MAPK signaling pathways significantly. Conclusion Apigenin can reduce LPS-induced macrophages inflammation and partly through NF-B and MAPK signaling pathways.KEY WORDS: apigenin; bone-marrow-derived macrophages; lipopolysaccharide;

8、NF-B; MAPK1 引 言炎症被认为是慢性病发病机制的主要因素之一。巨噬细胞作为重要的免疫细胞, 可以通过分泌趋化因子募集其他的免疫细胞进入炎性位点或者分泌炎性因子极化或者活化其他免疫细胞从而增加炎性1。因为长期的促炎性的状态会形成慢性炎症疾病, 如类风湿性关节炎、牛皮癣、炎症性肠病2, 所以巨噬细胞是慢性炎性相关疾病的重要研究对象。炎性状态往往伴随着许多信号通路的参与, 并转录调控炎性基因的表达, 其中MAPK和NF-B信号通路在炎性过程中起到了十分重要的调节作用3。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)作为革兰氏阴性菌膜上的重要组成部分之一, 是一种能够引起炎性反应的

9、诱导剂4,5。在LPS的处理下, 会诱导巨噬细胞向M1型的转变, NF-B和MAPK信号通路被激活, 并且分泌很多炎性因子, 如IL-1、IL-6、MCP-1是基因还是蛋白?基因需要斜体，蛋白不用，请核实等3。因此本研究采用此种处理方式进行研究。芹菜素, 又名4',5,7-三羟基黄酮, 广泛存在于水果和蔬菜中6,7。近年来, 已经有一些报道证明芹菜素有抗炎、抗氧化、抗癌的效果6。但芹菜素对LPS诱导的骨髓来源的巨噬细胞的作用的报道很少。因此, 本研究重点考察了芹菜素对小鼠骨髓来源的巨噬细胞炎性的作用。2 材料与方法2.1 材料与试剂C57BL/6小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)

10、; L929细胞(北京协和医院细胞资源中心); 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、LPS、噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT)(美国Sigma公司); 细胞培养基(cell culture media, DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、双抗(美国GIBCO公司); RNAiso Plus试剂、PrimeScriptTM RT Reagent试剂盒和SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒(日本TaKaRa公司); 逆转录试剂盒(美国Invi

11、trogen公司); Apigenin(南京春秋生物工程有限公司); 胰酶(美国Hyclone公司); 化学发光底物ECL(美国Thermo Scientific公司); NF-B抗体试剂盒、MAPK抗体试剂盒、-actin抗体(美国Cell Signaling Technology公司); 羊抗兔lgG(美国KPL公司); 异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)(美国Biolegend公司); 三氯甲烷、氯仿、异丙醇(分析纯,

12、国药集团化学试剂有限公司)。2.2 实验仪器与设备细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司); 超净工作台(上海智诚公司); 漩涡混合器(琪特仪器公司); 低速离心机(美国Sigma公司); 高速冷冻离心机(上海天美生化仪器公司); 酶标仪、定量PCR仪、蛋白电泳槽(美国Bio-Red公司); 摇床(Kylin-Bell公司); 分光光度计(德国Eppendorf公司); 生物显微镜(奥特光学公司); 荧光显微镜(Nikon公司); 荧光呈像系统(瑞典GE Healthcare 公司); 台式吸引器(绍兴卫星医疗设备公司); 纯水仪(英国ELGA公司); 高压灭菌锅(上海申安医疗

13、器械公司)。2.3 实验方法2.3.1 细胞培养(1) L929细胞培养用DMEM+10%胎牛血清(FBS)的培养基培养L929细胞, 每2 d更换1次培养基, 到细胞生长到单层融合后, 更换新的细胞液, 3 d后收集上含巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的细胞培养基。(2) 骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)培养用CO2将C57BL/6小鼠处死, 取完整后肢并且浸泡在75%乙醇中。尽快将胫骨和腓骨与肌肉组织分离, 用无菌注射器吸取DMEM培养基将骨髓吸出到培养皿中, 用移液枪移入50 mL离心管中, 1500 r/min离心5 min。弃上清之后, 用含有20%FBS和30%L929细胞培养基

14、的DMEM培养基, 37 5%CO2条件下培养, 每3 d换1次液。大约培养6 d骨髓细胞分化成BMDMs, 用10、30 mol/L的芹菜素, 对照组加入等量的二甲基亚砜(DMSO), 处理12 h。之后加入100 ng/mL LPS(处理30 min用于Western-blot实验, 处理4 h用于定量PCR实验), 最后用PBS洗2遍并收集细胞。2.3.2 MTT实验将已经分化成的BMDMs细胞用胰酶消化后, 接到96孔板上, 大约每孔103104细胞, 20%FBS和30%L929细胞培养基的DMEM培养基, 37 5%CO2条件下培养。待细胞长到单层铺满并融合后, 用0、10、20、

15、30、40、50 mol/L芹菜素处理BMDMs 24 h。用PBS清洗2遍, 每孔加入150 L培养基和20 L MTT, 培养4 h。用PBS清洗2遍, 每孔加入150 L DMSO并低速振荡10 min, 紫色结晶溶解完全后用酶标仪测定OD490值。2.3.3 定量PCR检测基因表达实验(1)细胞总RNA提取用于提取RNA的BMDMs细胞培养于24孔板, 用PBS洗1遍后, 每孔加入300 L RNAiso Plus, 放平培养板使其与BMDMs充分接触, 然后用移液枪反复吹打, 待细胞裂解充分后, 转入0.5 mL EP管中, 室温静置5 min。向细胞裂解液中加入60 L的氯仿, 充

16、分振荡并静置5 min, 之后12000 g 4 离心15 min。此时分为3层: 上层澄清溶液, 中间白色蛋白层和下层有机层。将上层澄清溶液转入新的0.5 mL EP管中, 加入与上清等体积的异丙醇, 充分震荡后, 室温静置10 min, 在将其在12000 g 4 离心10 min离心, 有白色沉淀产生。将上清倒掉后, 加入1 mL 75%乙醇清洗沉淀中残留的氯仿, 与上次离心放置方向一致, 再次离心, 以防止沉淀丢失。弃去乙醇保留沉淀, 室温放置510 min, 加入适量的RNAase-free 水溶解沉淀, 存于-80 。(2) RNA的反转录取2 L RNA加入到198 L去离子水中

17、, 利用分光光度计测定提取RNA的浓度。根据PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒说明书进添加逆转录试剂, 37 反应30 min后再用85 水浴处理5 s后终止逆转录, 即得到了cDNA。(3)定量PCR每个样品建立20 L反应体系: TaKaRaSYBR®Premix Ex TaqTM 10 L; 上游引物0.4 L、下游引物0.4 L、双蒸水8.2 L、cDNA 1 L。充分振荡混匀体系并短暂离心后放在Bio-rad IQ2定量PCR仪器中进行反应。用CT阈值循环方法进行数据处理, 用目的基因相对于GAPDH的水平表示目的基因的表达水平。用于实时定量PCR引

18、物序列详见表1。2.3.4 Western-blot 实验(1) 细胞的总蛋白提取用于提取蛋白的BMDMs细胞培养于6孔板, 每孔加入200 L预冷RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂和胰酶抑制剂)后将细胞刮下, 转移到EP管中, 每孔再加入300 L裂解液后转移到EP管中。将蛋白裂解液放于冰上, 摇床上摇晃30 min, 以便于细胞充分裂解。裂解过程结束后, 将EP管12000 g 4 离心30 min, 吸取上清转移到新的EP管中, 即得到BMDMs细胞的总蛋白。以BSA为标准品, 检测所提蛋白的浓度。每个样品加入其1/4体积的上样缓冲液, 100 煮沸10 min后, 分装并冻存于-80 。(

19、2) Western-blot电泳: 根据分子克隆实验指南的配方配制胶。装配好电泳槽, 向电泳槽中加入电泳缓冲液。取出冻存于-80 蛋白样品, 融化, 混匀后上样。80 V电压电泳30 min后, 将电压调为120 V。等到蓝色上样缓冲液完全跑出胶之后终止电泳。转膜: 200 mA恒流转膜2 h。封闭: 转膜结束后, 取出PVDF膜, 用脱脂牛奶室温封闭2 h。一抗二抗: 用TBST清洗PVDF膜上残留的牛奶后, 孵育一抗, 4 过夜。用TBST洗3次, 每次5 min。之后孵育二抗, 室温2 h。再用TBST洗3次, 每次5 min。ECL显影。用凝胶成像仪拍照并分析。2.3.5 P65荧光

20、定位实验细胞固定: 将BMDMs细胞板放在冰上, 用遇冷的PBS清洗2遍。用甲醇固定, 5 min后吸走, 在空气中晾干大概1015 min。封闭: 加入含有2%BSA的PBS溶液进行封闭, 室温条件下处理30 min。孵育一抗: 封闭完成之后, 弃去封闭液, 加入NF-B P65抗体(1:500), 室温孵育1 h。之后用PBS清洗3次, 每次5 min。孵育二抗: 在孔板中加入BL-羊抗兔(1:200), 避光条件下, 室温放置1 h。之后用PBS清洗3次, 每次5 min。孵育三抗: 在孔板中加入FITC (1:300)和DAPI(1:100), 室温避光条件下放置2 h, 之后用PBS

21、清洗3次, 每次5 min。每张片子随机选取5个视野, 400倍数条件下进行拍照并分析。2.3.6 统计学方法文章中的所有数据都是用平均值±标准误来表示, 细胞分析中不同组之间用t检验。当P<0.05视为具有统计学显著性, 用*表示。3 结果与分析3.1 芹菜素对LPS诱导BMDMs炎性和极性的影响为了探讨芹菜素对LPS诱导的BMDM炎性的影响, 首先探讨不同浓度芹菜素对BMDMs细胞活性的影响。如图1A所示, 与对照组相比, 40 mol/L芹菜素开始降低细表1 定量PCR的引物序列Table 1 Primers for quantitative real-time PCR基

22、因正向引物序列(5' to 3')反向引物序列(5' to 3')GAPDHTGTCATACTTGGCAGGTTTCTCGTGTTCCTACCCCCAATGTIL-1GCAACTGTTCCTGAACTCAACTTCTTTTGGGGTCCGTCAACTIL-6CCTTCCTACCCCAATTTCCAAAGATGAATTGGATGGTCTTGGTCMCP-1CCCCAAGAAGGAATGGGTCCGGTTGTGGAAAAGGTAGTGGINOSCCAAGCCCTCACCTACTTCCCTCTGAGGGCTGACACAAGGARG1CTCCAAGCCAAAGTCCTT

23、AGAGAGGAGCTGTCATTAGGGACATC图1 A: 不同浓度的芹菜素对BMDMs细胞存活率的影响; BD: 芹菜素对BMDMs炎性基因IL-6、MCP-1和IL-1表达的影响; E: 芹菜素对BMDMs中M1型巨噬细胞标记基因INOS表达的影响; F: 芹菜素对BMDMs中M2型巨噬细胞标记基因ARG1表达的影响Fig. 1 A: The effect of different concentrations of apigenin on BMDMs cell viability; BD: The effect of apigenin on BMDMs inflammatory ge

24、nes expression: IL-6, MCP-1 and IL-1; E: The effect of apigenin on M1 macrophages marker gene INOS expression in BMDMs; F: The effect of apigenin on M2 macrophages marker gene ARG1 expression in BMDMs胞存活率近50%。为了避免过量的芹菜素本身对细胞活性的影响, 选择10、30 mol/L芹菜素培养细胞, 从图1B、图1C中可以看出, 芹菜素可以降低LPS诱导的BMDMs中炎性基因IL-6、MCP-

25、1和IL-1的表达, 并且随着剂量的增加抑制效果更显著。因为在LPS的刺激下从M2抗炎性巨噬细胞向M1促炎性巨噬细胞转变8。图1E、图1F显示, 在芹菜素处理下, M1型促炎性巨噬细胞的标记基因INOS明显降低, M2型抗炎性巨噬细胞的标记基因ARG1显著升高。这些结果也证明芹菜素可以明显降低LPS诱导的BMDMs的炎性, 抑制BMDMs向促炎性的转变, 且这个现象呈现剂量依赖的趋势。3.2 芹菜素抑制LPS诱导的BMDMs中NF-B信号通路的激活因为NF-B转录调控的炎性因子在芹菜素的处理下有所改善, 所以进一步考察芹菜素是否影响到NF-B信号通路。从图2A图2E可以看出, LPS导致的p-

26、IKK/激活在芹菜素处理下降低了60%左右, IKK呈现出了降低的趋势, IKK总蛋白也明显降低。在IKK的影响下, IB磷酸化和降解都有明显的改善。因为炎性基因的转录是发生在NF-B P65进入细胞核之后, 所以用荧光定位实验检测芹菜素是否影响了NF-B P65进入细胞核。从图1F中可以看出, 在加入芹菜素之后, NF-B P65进入细胞核明显降低。这些结果也就说明, 芹菜素可以抑制LPS诱导的BMDMs中NF-B信号通路的激活, 从而降低对炎性因子的转录表达。3.3 芹菜素抑制LPS诱导的BMDMs中MAPK信号通路的激活因为MAPK作为另外一条重要的调控炎性因子表达的信号通路, 在这里也

27、做了相应的考察, 并且MAPK是由3个主要的信号通路组成: ERK、JNK、P38 MAPK9。由于JNK和P38 MAPK主要是受到代谢压力如渗透休克, 厌氧, 热休克等的影响, 特别是在LPS、TNFs刺激下产生大量的促炎性因子10,11。所以, 这里重点考察对JNK和P38 MAPK的影响。在图3A图3E中, 芹菜素可以明显降低p-JNK(约40%)和p-P38 MAPK(约50%)。总之, 芹菜素可以通过MAPK信号通路调节LPS诱导BMDMs的炎性。4 讨 论巨噬细胞作为各个组织中很重要的炎性细胞, 经历了几个重要的分化阶段, 从骨髓造血干细胞到血液中的单核细胞, 再分化成为各个组织

28、的巨噬细胞12。目前虽然已经有芹菜素对于抑制LPS诱导的巨噬细胞炎性的报道, 但是, 都是采用单一的细胞系, 比如RAW264.713、小鼠ANA-1巨噬细胞14、人的THP-1诱导的巨噬细胞和小鼠J774A.1巨噬细胞15的细胞系。为了模拟巨噬细胞在体内的情况, 本研究选取小鼠的骨髓细胞, 通过诱导得到巨噬细胞16并做一系列的考察。芹菜素是重要的黄酮类物质, 广泛存在于自然界当中, 有些报道已经证明了它在抗炎、抗癌等方面发挥着巨大的作用17-21。本研究重点考察了芹菜素与BMDMs之间的关系。考虑到剂量过高会影响到细胞正常的生命活动, 通过MTT实验得到最大使用浓度为30 mol/L, 并且

29、增设了10 mol/L剂量去考察芹菜素的剂量和改善炎性效应和细胞极性的关系。BMDMs在LPS处理条件下通过TLR4会激活NF-B, MAPK等信号通路后会调控转录调节炎性因子的表达, 例如IL-6、IL-1等22, 并且巨噬细胞在募集之后会自身分泌MCP-1, 募集更多的巨噬细胞启动炎性过程1。所以, 在研究芹菜素对BMDMs炎性的作用时检测了MCP-1, IL-6和IL-1, 得知芹菜素能够明显降低BMDMs炎性因子的表达。芹菜素还能够明显降低INOS, 升高ARG1, 说明芹菜素促进BMDMs向M2型巨噬细胞转化。进一步对调控炎图2 A: 芹菜素对NF-B信号通路蛋白表达的影响(-act

30、in作为基准); BE: NF-B信号通路中p-IKK/、IKK、IKK和p-IB/IB蛋白表达的定量结果; F: 芹菜素对NF-B P65蛋白核转移的荧光定位结果Fig.2 A: The effect of apigenin on NF-B signaling pathway protein expression (-actin as control); BE: The quantitative results of p-IKK/, IKK, IKK and p-IB/IB protein expression; F: The effect of apigenin on NF-B P65 n

31、ucleus traslocation图3 A: 芹菜素对MAPK信号通路蛋白表达的影响(-actin作为基准); BE: MAPK信号通路中p-JNK、JNK、p-P38 MAPK和P38 MAPK蛋白表达的定量结果Fig. 3 A: The effect of apigenin on MAPK signaling pathway protein expression (-actin as control); BE: The quantitative results of p-JNK, JNK, p-P38 MAPK and P38 MAPK protein expression性基因的NF

32、-B和MAPK炎性信号通路分别进行考察, 对于NF-B信号通路, 芹菜素能够明显降低p-IKK/和p-IB, NF-B p-65的核转位明显降低, 这一结果和之前的芹菜素降低PPAR和P65复合物进入核的结果相似23。因为在LPS刺激条件下, 激活的P38 MAPK会调控到NF-B的激活, 且TLR4的激活通过TAK1调控JNK和P38 MAPK的激活10, 芹菜素会明显改善p-P38 MAPK和p-JNK的激活。综上所述, 芹菜素可以降低LPS诱导的BMDMs的炎性, 促进巨噬细胞向M2型转变, 而且这一抗炎的现象可以通过调控NF-B和MAPK信号通路实现。参考文献1 Sica A, Man

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