伽玛刀不同剂量照射正常大鼠一侧尾壳核后延髓内Fos蛋白的表达及变化

1、    伽玛刀不同剂量照射正常大鼠一侧尾壳核后 延髓内Fos蛋白的表达及变化         摘要：目的观察-刀不同剂量照射正常大鼠一侧尾壳核后3个月，远离靶区的延髓中尾段内Fos的表达和变化及与剂量的关系。方法分别用10Gy至100Gy 10个级别剂量照射大鼠一侧尾壳核，3个月后，用ABC法对延髓中尾段切片进行抗Fos蛋白的免疫组织化学反应。结果在延髓内脏带、三叉神经尾侧亚核、三叉神经间质核、延髓背侧网状核和下橄榄核等处出现多少不等的Fos阳性胞核，随着剂量的增加

2、Fos阳性胞核的数量增加，范围扩大。在高剂量组的延髓腹外侧区出现3种Fos阳性细胞：胞核阳性、胞浆阴性；胞浆阳性、胞核阴性；胞核胞浆均为阳性。结论-刀照射前脑一个局部，在远离靶区的延髓中尾段出现Fos阳性反应，并与剂量成正相关。关键词：-刀；延髓；Fos；延髓内脏带；免疫组织化学分类号：R8文献标识码：A文章编号：0529-1356(2000)01-21EXPRESSION AND CHANGE OF Fos IN THE MEDULLAOBLONGATA OF RAT FOLLOWING EXPOSURE TOVARIOUS DOSE OF GAMMA KNIFERAO Zhi-ren(In

3、stitute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)WU Sheng-ling(Guang dong Minimally Invasive Neurosurgery Medical Center,Guang zhou 510630,China)QIU Jian-yong(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)XU Xin(Guang don

4、g Minimally Invasive Neurosurgery Medical Center,Guang zhou 510630,China)DUAN Xiao-qin(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)JU Gong(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)Abstract：ObjectiveTo observe

5、alterations in Fos protein expression in middle-caudal segment of the normal rat medulla oblongata after the unilateral caudate putamen nucleus was irradiated with different dosage of gamma knife.MethodsThe caudate putamen nucleus was irradiated with various dosage from 10Gy to 100Gy of gamma knife.

6、The rats were sacrificed 3 months after irradiation and fixed and cut with cryostat.The sections of the medulla oblongata were reacted with anti-Fos protein immunohistochemical ABC method.ResultsAt low dosage,Fos positive nucleus was observed in medullary visceral zone,caudal subnucleus of trigemina

7、l nerve,intertrigeminal nucleus of trigeminal nerve,dorsal medullary reticular nucleus and inferior olive nucleus.With the dosage increasing,both the number and distribution scope of positive nucleus was increased.In the high dosage group,three types of Fos positive expression appeared in ventrolate

8、ral medulla oblongata nucleus.The three types were:only the nucleus was stained;only cytoplasm was stained;both nucleus and cytoplasm were stained.ConclusionThough a local nucleus in the forebrain was exposed to gamma knife,the distant area of middle-caudal segment of the medulla oblongata showed Fo

9、s positive reaction and the reaction was positively related with dosage.Key words：Gamma knife;Medulla oblongata;Fos;Medullary visceral zone;Immunohistochemistry-刀定位照射是某些颅内疾病(脑血管畸形、脑肿瘤及脑功能性疾病)的非手术治疗方法之一。有关-刀的放射神经生物学的基础研究虽有一些报告，但仍比较薄弱，Kandziolka等13曾做过比较系统的观察，他曾用-刀(30、40、50、60、70、80、100、150、200Gy)定位照射一

10、侧尾状核头部，动物成活90d后靶区的组织学变化，结果照射剂量少于70Gy，在光镜下未见到组织学的改变；在70100Gy发现神经元的大小与形态有变化，小动脉壁增厚，血红细胞或蛋白渗出血管外，并有点状坏死；150200Gy照射后17d脑未出现病理学改变，14d出现靶区的脑水肿，21d后靶区出现一直径为4mm的坏死。这一结果初步提示了靶区脑组织的变化与剂量及成活时间的关系，由于他们只是用组织学方法仅观察了靶区组织的变化，说明的问题很局限，因此有必要对-刀照射正常大鼠脑部后，脑组织的变化进行更深入的研究。为此我们进行了两方面的工作，第1用100Gy剂量的-刀照射正常大鼠一侧尾状核头部，动物分别成活0.

11、5、1、3、6、12h及1、3、7、14、30和90d后，采用组织学方法(HE染色)，组织化学方法(NADPH-diaphorase染色)，抗Fos蛋白，抗GFAP，抗0x42，和抗HSP70等免疫组织化学技术，观察全脑(包括靶区和非靶区)血管内皮，神经元，星形胶质细胞和小胶质细胞的变化及其与时间的效应关系。第2用10、20、30、40、50、60、70、80、90和100Gy的-刀照射正常大鼠一侧尾状核头部，动物均成活90d，采用上述方法观察全脑组织的变化及其剂量的效应关系。我们仅就用10Gy至100Gy不同剂量的-刀照射后延髓内Fos蛋白的表达及变化作一报告，其他结果另行报告(请参阅“全国

12、首届微侵袭神经外科学术会议论文汇编”，广州，1998：66119)。材料和方法共用SD成年雄性大鼠(体重200g)34只，其中实验组30只，对照组4只。1.实验组2.对照组和对照实验2.1正常对照组：2只正常大鼠未经MRI和-刀处理，在深麻下按实验组方法对动物进行灌流固定、切片和免疫组织化学反应。2.2对照实验：大鼠2只在麻醉下固定于专用固定架上，放在-刀室(不受-刀直接照射)30min，动物成活90d按实验组步骤灌流固定，切片和免疫组织化学反应。2.3替代实验：随机抽取实验组切片若干，用KPBS替代第一抗体，浸泡切片48h(4)，其余步骤与实验组相同。结果未见到Fos阳性产物。结果1.正常对

13、照组和对照实验仅在延髓内脏带(MVZ)的孤束核(NTS)和腹外侧延髓(VLM)有少数散在的Fos阳性胞核，其他部位为阴性。2.实验组为了叙述方便，我们参照有关文献1，2将照射剂量分为3个剂量级，即低剂量级(1030Gy)，中剂量级(4060Gy)和高剂量级(70100Gy)。2.1低剂量组(1030Gy)：Fos阳性胞核出现在下列结构，(1)MVZ中有少量Fos阳性胞核，主要分布于NTS的内侧亚核(1)，VLM的表面和腹外侧网状核(2)，而MVZ中间部(IRt)则较少。MVZ内Fos阳性胞核的数量详见表1。(2)双侧延髓背侧网状核内有Fos表达(3)。(3)三叉神经尾侧亚核(Sc5)有少量Fo

14、s胞核，以浅层为主，其他层均散在出现，照射侧多于非照射侧；三叉神经极间亚核以上部位则明显减少。(4)双侧三叉神经束间核也有少量Fos阳性胞核。    110Gy照射后，最后区平面MVZ内孤束核(NTS)的Fos表达×100(下同)Fig.1Expression of Fos in NTS of MVZ at area postrema (AP) level of rat after irradiating with 10Gy of gamma knife. ×100(The same as follows)  &#

15、160; 210Gy照射后，最后区平面MVZ内腹外侧延髓(VLM)的Fos表达Fig.2Expression of Fos in VLM of MVZ at AP level of rat after irradiating with 10Gy    310Gy照射后，延髓背侧网状核的Fos表达Fig.3Expression of Fos in the dorsal reticular nucleus of the medulla oblongata of rat after irradiating with 10Gy表1低剂量组(1030Gy

16、)9只大鼠MVZ内Fos阳性胞核的计数Table 1Enumeration of Fos positive nuclei in MVZ ofthe rat (n=9) irradiated by low-dose(10-30Gy)锥体交叉平面Pyr.level最后区平面AP.level闩平面Obex.level闩吻侧平面rostal levelto obexNTS503852206108IRt901637870VLM8071 053402280总数total1 4002 068986458均数/只average/per rat155.5229.7109.550.9  

17、60;  2.2中剂量组(4060Gy)，上述区域内的Fos阳性胞核有所增加，(1)MVZ的NTS、VLM和IRt Fos阳性胞核增加明显，形成一条弧形带状分布区，在VLM，Fos阳性胞核分布于表面，外侧网状核小细胞部，腹外侧网状核和三叉下核(46)。MVZ内的Fos阳性胞核计数详见表2。(2)三叉神经尾侧亚核Fos阳性胞核有增加，仍以照射侧较多。(3)双侧延髓背侧网状核有较多的Fos阳性胞核，位于NTS之腹外侧，IRt背外侧与三叉神经尾侧亚核背侧之间。    450Gy照射后，闩平面MVZ内NTS的Fos表达Fig.4Expression o

18、f Fos in NTS of MVZ at the obex level of rat after irradiating with 50Gy    550Gy照射后，闩平面MVZ内中间网状带(IRt)的Fos表达Fig.5Expression of Fos in IRt of MVZ at the obex level of rat after irradiating with 50Gy    650Gy照射后，闩平面MVZ内VLM的Fos表达Fig.6Expression of Fos in VLM of M

19、VZ at the obex level of rat after irradiating with 50Gy表2中剂量组(4060Gy)9只大鼠MVZ内Fos阳性胞核的计数Table 2Enumeration of Fos positive nuclei in MVZ ofthe rat (n=9) irradiated by mid-dose(40-60Gy)锥体交叉平面Pyr.level最后区平面AP.level闩平面Obex.level闩吻侧平面rostal levelto obexNTS8031 252406214IRt26146017898VLM1 0741 603504381总数

20、total2 1383 3151 188693均数/只average/per rat237.5268.3132.077     2.3高剂量组(70100Gy)，Fos表达的主要特点如下：(1)MVZ内Fos阳性胞核明显增多，形成一条弧形带状区。NTS的Fos阳性胞核主要分布于弧束周围(7)；VLM的Fos阳性胞核散在分布于VLM各结构(8)；IRt有较多的散在Fos阳性胞核(9)。从锥体交叉平面至闩吻侧平面，Fos阳性胞核有所减少。MVZ内Fos阳性胞核计数详见表3。(2)双侧三叉神经尾侧亚核有较多的Fos阳性胞核，浅层较密集，深部各层也有散在分布；极

21、间亚核以前偶见Fos胞核。(3)双侧三叉脊束束间核有少量Fos阳性胞核。(4)双侧外侧楔束核、下橄榄核有少量Fos阳性胞核。(5)双侧延髓背侧网状核有较密集的Fos阳性胞核。(6)在VLM观察3种Fos阳性细胞(神经元或神经胶质细胞)，即Fos阳性胞核，胞浆为阴性；Fos阳性胞浆，胞核为阴性；胞浆和胞核均为Fos阳性(1012)。    770Gy照射后，最后区平面MVZ内NTS的Fos表达Fig.7Expression of Fos in NTS of MVZ at AP level of rat after irradiating with 70Gy

22、    870Gy照射后，最后区平面MVZ内IRt的Fos表达Fig.8Expression of Fos in IRt of MVZ at AP level of rat after irradiating with 70Gy    970Gy照射后，最后区平面MVZ内VLM的Fos表达Fig.9Expression of Fos in VLM of MVZ at AP level of rat after irradiating with 70Gy    1070Gy照射

23、后，VLM内3种Fos阳性细胞，. 胞核阳性者；. 胞浆阳性者；. 胞核胞浆均阳性者×200Fig.10Three kinds of Fos positive cells in VLM of rat after irradiating with 70GyFos positive only in nuclei of cells, Fos positive only in cytoplasm,Fos positive in both nuclei and cytoplasm.×200(The same as follows)    117

24、0Gy照射后，VLM内胞核胞浆均Fos阳性细胞×200Fig.11Three kinds of Fos positive cells in VLM of rat after irradiating with 70GyFos positive only in nuclei of cells, Fos positive only in cytoplasm,Fos positive in both nuclei and cytoplasm.×200(The same as follows)    1270Gy照射后，VLM内Fos阳性细胞&

25、#215;200Fig.12Fos positive cells in VLM after irradiating with 70Gy×200表3高剂量组(70100Gy)12只大鼠MVZ内Fos阳性胞核的计数Table 3Enumeration of Fos positive nuclei in MVZ ofthe rat (n=12) irradiated by hight-dose(70-100Gy)锥体交叉平面Pyr.level最后区平面AP.level闩平面Obex.level闩吻侧平面rostal levelto obexNTS1 2411 867608364IRt582

26、872378116VLM1 5082 043784420总数total3 3314 7821 770950均数/只average/per rat277.5498.5147.570.8     总之，从低剂量至高剂量延髓内Fos阳性细胞数量增加，分布范围也逐渐扩大；MVZ是一个敏感区，Fos阳性细胞较密集，特别是NTS和VLM，在锥体交叉平面和最后区平面Fos阳性胞核较多，向吻侧至闩平面和闩吻侧平面Fos表达有所减少；双侧三叉神经尾侧亚核有Fos表达，极间亚核以吻部位则极少；在高剂量组可见到3种Fos阳性细胞。 讨论1.关于刀照射大鼠脑部模型的建立1.1靶

27、区位置的选定，本实验将靶区定于尾状核头部，其理由如下：(1)由于所用-刀装置是用于人脑的，最小的准直器直径为4mm,这就决定了射线集中照射中心区，直径最小为4mm，大鼠脑内仅尾状核头部较大超过4mm，结构比较单一，其他区域结构复杂，涉及的核团较多，增加了对结果解释的难度；(2)由于大鼠脑子小，在MRI扫描上只有尾状核头部易于辨识；(3)国外已有学者用此作为靶区2。1.2照射剂量，我们选定从10Gy到100Gy的10个等级剂量，临床治疗用的剂量在此范围内3，虽然有的学者在动物实施过150Gy和200Gy的照射，远远超过了临床的实际用量，故未选用。1.3动物的成活时间，我们参考有关文献13将-刀照

28、射后，脑组织的放射神经生物学效应分为早期(即照后90d以内)，中期(照后90d至1年)和长期(照后1年以上)。我们观察的是早期变化。2.关于Fos蛋白的表达及其意义2.1Fos蛋白表达显示技术的优缺点c-fos早期原癌基因(c-fos proto oncogene)是存在于细胞内的第三信使，当受到刺激时，大多数细胞的反应是c-fos mRNA和Fos蛋白的早期表达。用原位分子杂交技术显示胞浆内的c-fos mRNA，用免疫组织化学方法显示胞核内的Fos蛋白。c-fos mRNA和Fos蛋白的显示技术作为神经系统的机能形态学方法已被广泛地采用4，5，6。当机体受到刺激时，神经系统与此机能相关的多

29、级神经元可能出现阳性表达，而且非常敏感，这是其优点。由于任何刺激均能引起相应神经元的c-fos表达，因此如何保证c-fos表达的特异性是至关重要的46。我们对实验条件进行了严格控制，尽量减少无关刺激对动物的影响，并设置了对照组，从而保证结果的可靠性。2.2-刀照射后脑内Fos阳性表达及其意义-刀照射后除靶区出现Fos阳性细胞外，在全脑某些非靶区部位(例如：皮质、侧脑室周围的白质、海马以及下丘脑、杏仁中央核和延髓)也出现Fos阳性细胞，并显示出与照射剂量和成活时间的相应关系，有关结果另有报告7，故不赘述。我们发现在大剂量(70100Gy)照射或照后较长时间成活(3个月)后出现3种Fos阳性细胞，

30、即(1)胞核阳性，胞浆阴性；(2)胞核阴性，胞浆阳性；(3)胞核、胞浆均为阳性。我们认为(1)为正常反应细胞，(2)是严重受损细胞，(3)是中间过渡性细胞，并专题作了报告8，在此不重复。我们主要讨论-刀照射尾状核头部后延髓内Fos表达及其变化的意义。延髓内脏带(MVZ)是一个位于延髓中尾段，从背内侧，穿经网状结构至腹外侧延髓(VLM)的弧形带状区，呼吸中枢、心血管中枢等均位于MVZ内，MVZ参与应激反应的调节，各种伤害性刺激(胃肠、心血管、躯体、内分泌、免疫刺激)均引起MVZ内神经元的Fos表达，关于MVZ的结构与机能，请参阅Rao和Ju的综述9。-刀照射脑部，造成靶区脑组织的损伤，细胞变性、凋亡或坏死，因此靶区组织又形成了一个新的伤害性刺激源，通过神经传导或神经体液途径引起应激反应，MVZ内细胞产生不同程度Fos表达。随着照射剂量的增加，靶区组织的损伤也加重，应激反应也随之加强，Fos阳性细胞增多。锥体交叉平面和最后区平面MVZ内Fos阳性胞核密集，向吻侧至闩平面和闩吻侧