泛素-蛋白酶体途径的组成和功能

1、泛素-蛋白酶体途径的组成和功能*倪晓光赵平(中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所,北京100021摘要泛素-蛋白酶体途径是细胞内蛋白质选择性降解的重要途径,泛素分子主要通过泛素活化酶、泛素结合酶和泛素-蛋白连接酶与靶蛋白结合形成一条多泛素链,最后被26S蛋白酶体识别和降解。泛素-蛋白酶体途径参与细胞内的多种活动过程,包括细胞凋亡、MHC I类抗原的递呈、细胞周期以及细胞内信号转导,与细胞的一些生理功能和病理状态有着密切的联系。本文主要对组成泛素-蛋白酶体途径的各成分作一综述。关键词泛素;蛋白酶体;泛素化;蛋白降解中图分类号Q519;R329.2泛素-蛋白酶体途径由泛素(ubiqui

2、tin,Ub、泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme,E1、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzymes,E2s、泛素-蛋白连接酶(ubiquitin-protein ligases,E3s、26S蛋白酶体和泛素解离酶(deubiquitinating enzymes, DUBs等组成,其对靶蛋白的降解是一种级联反应过程(图1。泛素首先在E1催化下,其C-末端甘氨酸残基与E1的半胱氨酸残基间形成高能硫酯键而获得活性。E1-泛素结合的中间体再将泛素转移给E2,形成E2-泛素中间体。最后靶蛋白的泛素化还需要另一个特异的泛素蛋白连接酶E3s。E3

3、s可以直接或间接与底物结合,促使泛素从与E2s形成的硫酯中间产物转移到靶蛋白赖氨酸残基的氨基基团上,形成异肽键(isopeptide bond。当第一个泛素分子连接到靶蛋白上后,另外一些泛素分子在E3s的催化下相继与底物相连的泛素分子的第48位赖氨酸残基相连,形成一条多聚泛素链,作为底物被蛋白酶体识别和降解的靶向性信号。完成泛素化的蛋白质结构被展平进入26S蛋白酶体,在20S催化中心中被降解,泛素分子可被DUBs从底物上水解下来,重复利用1。本文主要对组成泛素-蛋白酶体途径的各成分作一综述。图1 蛋白质经泛素-蛋白酶体途径降解示意图一、泛素(Ub泛素是1975年由Goldstein首先发现的一

4、种在真核生物细胞内高度保守的多肽,单个泛素分子由76个氨基酸组成,分子量约8.5kD。泛素分子紧密折叠成球形,5股混合的片层形成一个腔样结构,内部对角线位置有1个螺旋,这个结构称为泛素折叠。这个小蛋白含有一个明显的疏水核心和大量的氢键,表现出特殊的稳定性,能够防止在结合和靶向性降解循环中变性失活,从而保证泛素循环的运行。从泛素折叠中突出来的是具有一定变形性的C 末端延伸部分,这个末端第76位含有一个必须的甘氨酸。泛素与其它蛋白都是通过C-末端第76位甘氨酸来连接的。二、泛素活化酶(E1E1是泛素与底物蛋白结合所需要的第一个酶,但是对靶蛋白的特异性却几乎没有影响。E1是一种广泛表达的多肽,大约1

5、100个氨基酸,含有位置固定的保守的半胱氨酸残基。E1有2个亚型,是由同一个mRNA在不同的起始位点翻译而成的,存在于细胞浆和细胞核中。酵母的E1基因失活后是致命的,说明这个蛋白对于细胞的生存是至关重要的(Stephen等.1996。E1可以水解ATP,与泛素的羧基末端形成高能硫酯键而激活泛素。在真核生物这个激活反应由两步构成:起始形成泛素-腺苷酸中间物,接下来这个中间物与E1半胱氨酸残基发生反应形成E1-Ub硫酯键。通常一个泛素分子有一*国家自然科学基金(30500582和“十五”国家科技攻关计划(2004BA703B11资助课题 个单独的E1。E1具有高度的催化效能,在低浓度的情况下就能够

6、激活泛素,满足下游的级联反应过程(Pickart.2001。三、泛素结合酶(E2s级联反应的第二步是泛素分子经过转硫醇反应从E1半胱氨酸残基转移给E2s活化的半胱氨酸位点。E2s在哺乳动物中至少有25个基因,所有的E2s都含有一个保守的大约150个氨基酸的核心结构域,在结构域的中央是决定E2s活性的半胱氨酸残基,位于蛋白表面浅的裂隙内(Hamilton等. 2001。E2s家族中的一小部分成员只含有这个核心结构,但是其它的大部分成员还有N-或C-末端的延伸,这种结构可能与E3s的识别、E2s自身的活性以及底物识别有关。E1和E3s通过相同的基序与E2s连接,这说明在反应循环过程中,E2s必须在

7、E1和E3s之间穿梭往返运行。因此为了保证在激活的泛素与数量巨大的E3s之间得到平衡的分布,需要多个E2s异构体。E2s/Ub非共价结合的亲和力非常低,说明其在转移泛素分子到靶蛋白上起着重要的作用。四、泛素-蛋白连接酶(E3s泛素化途径最重要的特征就是底物的多样性和选择性,这一功能由E3s直接决定。目前主要有3种类型的E3s,即含有HECT(homologous to E6-as-sociated protein carboxyl terminus结构域的E3s、含有环指状(RING finger结构域的E3s和含有U-box 结构域的E3s2。在高等生物E3的总数从几百到一千以上,新的E3亚

8、家族仍不断被发现。正是由于这些复杂多变的E3s家族成员可以对不同的底物进行特异性的识别,才呈现出蛋白降解的高度选择性。(一含有HECT结构域的E3s HECT E3s的命名是因为其C-末端含有一段大约350个氨基酸的区域与E6-AP(E6-associated protein的C-末端同源。HECT E3s催化转硫醇反应将E2s中的泛素转移给HECT结构域内的保守的半胱氨酸残基。E6AP-HECT/UbcH7复合体的晶体结构显示HECT 结构域呈L形,活性位点位于L形的拐弯处(Huang 等.1999。游离的HECT结构域与E2s有较强的相互作用,E2s结合位点位于L形基底部的末端。HECT结

9、构域的缺失不影响底物的结合,高度可变的N末端结构域负责对特异底物的识别和结合。(二含有环指状结构域的E3s 其特征是含有一个保守的组氨酸和半胱氨酸残基复合体,在其中心有2个Zn2+离子。RING E3s没有直接催化蛋白泛素化的作用,其作为一个停靠位点将靶蛋白和E2s聚集在一起,然后介导泛素的转移而不是与泛素形成硫酯键。含有环指状结构域的E3s可被分成2种类型,一种是单个蛋白,其代表是作为P53的E3s的MDM2(mouse double minute2癌蛋白(Hon-da等.2000以及作为受体酪氨酸激酶如表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EG

10、FR和血小板衍生因子受体(platelet-derived growth factor receptorE3s的c-Cbl(Tsygankov等.2001。另一种是多蛋白组成的复合体,包括SCF(Skp1-Cullin/ Cdc53-F-box-Rbx1、有丝分裂后期促进复合物(an-aphase promoting complex,APC和VBC-Cul2复合体(the von-Hippel-Lindau-elongins B and C-Cul2 complex。SCF E3s是至少有4种多肽组成的复合体。被命名为SCF是因为其中的三个核心亚基(Skp1、Cul-lin/CDC53和一个F

11、-Box蛋白。后来第四个亚基Rbx1(RING box1protein被发现,其含有一个RING H2-型结构域。在SCF E3s中的Rbx1能够集合E2,Cullins蛋白作为Rbx1与蛋白之间的支架参与底物的选择性。底物的识别由底物特异性的F-box蛋白所介导,F-box本身被SCF E3s复合体中的Skp1接头因子所识别和聚集。Skp1与Cullins结合,因此将底物和泛素并列排开。F-box蛋白的特征是含有一个大约40个氨基酸的基序,最初在细胞周期蛋白F中鉴定出来。人类含有大量的F-box蛋白,可以分成不同的亚类,在多数情况下F-box蛋白结合磷酸化的蛋白质。如SCF E3s通过引起p

12、27和cdc25的快速降解来调节细胞周期3。APC的核心颗粒至少含有13个亚基,最初发现在降解Cyclin的过程中起着重要作用。随后研究发现,其具有控制在有丝分裂进展和结束过程中起着至关重要的一些因子的半衰期的功能4。APC中的2个亚基APC2和APC11分别与SCF E3s复合体中的Cullin1和Rbx1相关,推测APC2可能具有连接其它亚基的作用,而APC11则具有结合Ub-E2s中间体的作用。von-Hippel Lindau(VHL肿瘤抑制因子蛋白E3复合体与SCF型复合体有所不同,其核心区有Rbx1和Cul2A结构,然而Skp1被转录延伸因子B/C所代替。转录延伸因子B/C复合体能

13、够调节VHL与其它蛋白的相互作用,包括RNA聚合酶II延长因子A和细胞因子信号转导抑制分子(suppressors ofcytokine signalling,SOCS盒装蛋白。这种复合体与靶蛋白特异结合的方式虽然简单,但是效率却很高(Kim等.2003。(三含有U-box结构域的E3s U-box E3s是一个相对较小的E3s家族,在结构上与RING结构域相似(Ohi等.2003,因此有的人将U-box E3s与环指状结构域的E3s归为一类。在一些情况下多泛素链的形成还需要泛素链延长因子的辅助,人们将具有这类功能的酶命名为E4s。U-box家族成员具有E4s的特点。第一个被鉴定的E4s家族是

14、泛素融合降解蛋白(ubiquitin fusion degradation2,UFD2,其特征是C末端含有一个大约70个氨基酸的保守的U-box,在结构上与RING-finger E3s相关,能与含有13个泛素分子的底物结合,催化其它的泛素分子附加到底物上,形成含有多泛素链的底物。U-box 家族的另一个成员是与热休克蛋白70碳末端相互作用蛋白(C terminus of Hsc70-interacting protein, CHIP,在降解途径中作为泛素链延长因子与另外的E3s协同作用,能够结合伴侣分子识别的异常或错误折叠的蛋白质,导致他们被26S蛋白酶体所降解,是另一个含有U-box的具有

15、E4功能的蛋白质。目前还不清楚是否含有U-box结构域的蛋白质都具有E4s的活性5。(四E3s与靶蛋白多聚泛素链的形成靶蛋白的泛素链最少需要四个泛素分子的长度才能够被蛋白酶体有效降解。关于靶蛋白的泛素链是如何形成的还不清楚,推测可能存在以下4种模型6:(1有序增加模型(sequential addition model也称为标准模型,即E3通过不同的结构域(如RING E3s与E2和底物结合,形成E2-E3-底物复合体,E3促使与E2连接的泛素分子直接转移到底物的赖氨酸残基,然后E2-E3-底物复合体中的E2再接受来自E1分子传递的新的泛素分子,在E3的作用下将泛素分子直接转移到与底物相连的第

16、一个泛素分子,接下来循环此过程,完成靶蛋白泛素链的组装;(2指数模型(indexation model是指在形成E2-E3-底物复合体后,E2上的第一个泛素分子首先与E3s的HECT结构域的半胱氨酸活化位点结合,然后依次在此位置形成一条泛素链,最后泛素链从E3上转移到底物的赖氨酸残基;(3秋千模型(seesaw model是指E3与2个E2和底物形成复合体后,泛素链的组装发生在2个E2的活化位点上,即一个E2上的泛素分子转移到另一个E2上后,新转移过来的泛素位于最底层直接与E2连接的位置,而原来与E2直接连接的泛素则与新转移过来的泛素相连,依此从后向前的方式形成一条泛素链,最后泛素链直接从E2

17、转移到底物上;(4杂和模型(hybrid model是指E2-E3-底物复合体形成后,E2上的泛素分子首先转移到E3上,在E3上形成一条泛素链,然后泛素链按照E3&E1&E2&底物的传递顺序连接到靶蛋白上。不同的E3s可能通过不同的机制组装靶蛋白的多泛素链。五、泛素解离酶(DUBs虽然泛素与细胞内快速降解的蛋白连接在一起,但是其本身却是长寿命蛋白,这是由于泛素蛋白偶连物在水解之前DUBs将泛素从底物上解离下来。DUBs属于蛋白酶超家族,根据其催化机制,可以分为5类(天门冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶,生物信息学研究显示大约有79个有

18、功能的DUBs7,其中大部分为半胱氨酸蛋白酶。DUBs能够识别最接近的泛素基序,特异性地在泛素和与其C末端最后一个残基(Gly76相连的分子之间断开(Amerik等. 2004。半胱氨酸蛋白酶型DUBs根据泛素-蛋白酶结构域又可分为4个亚类:泛素特异性蛋白酶(USP、碳末端水解酶(UCH、卵巢肿瘤蛋白酶(OTU和MJD蛋白酶。金属蛋白酶型DUBs的泛素-蛋白酶结构域称为JAMM(JAB1/MPN/Mov34 metalloenzyme(Amerik等.2004。半胱氨酸蛋白酶的活性信赖于活性位点中的一个半胱氨酸的硫醇基团。这个半胱氨酸在邻近组蛋白的辅助下去质子化,在一个天门冬氨酸残基的作用下产

19、生极性,这三个氨基酸残基构成催化三联体。在催化过程中,半胱氨酸表现出亲质子作用,攻击靶蛋白与泛素之间易断裂肽键的羰基端,结果将靶蛋白释放出来,泛素与UDBs形成一个共价连接的中间体。中间体与水分子反应释放出游离的酶和泛素。六、26S蛋白酶体26S蛋白酶体是降解泛素化底物的一个ATP依赖型蛋白水解复合体,由20S核心蛋白酶(core pro-tease,CP和19S调节颗粒(regulatory particle,RP构成。CP是由4个七聚体蛋白组成的环层叠在一起形成的一个空心圆柱体样结构(1-71-71-71-7,是26S蛋白酶体的水解核心。活性位点位于20S圆柱体空心结构中心的2个环上,含有

20、胰蛋白酶、糜蛋白酶和谷氨酰样肽水解活性,具有能够使大多数肽键断裂的能力(Voges等.1999。2个亚基的氨基末端封住蛋白水解腔隙的入口,对蛋白酶体CP的活性具有自身抑制作用,这样只有进入蛋白酶体圆柱体内部的蛋白才能够被水解。RP由基底(Base和盖子(Lid两个亚单位组成,分别与CP两端的环相结合。基底亚单位是由6个相关的AAA-ATPases RPT1-6(regulatory particle triple-A protein和3个non-ATPase RPN(regulatory particle non-ATPase1、2和10组成的环状结构,能够活化20S核心颗粒(Glickman

21、等.1998。盖子亚单位含有其余的non-ATPase(RPN3、5-9、11和12,是泛素依赖性蛋白降解所必须的(Fu等.2001。靶蛋白进入蛋白酶体需要底物传送蛋白的辅助,这些蛋白含有UBL或UBX(ubiquitin-like pro-tein和UBA(ubiquitin-associated结构域,包括Rad23(radiation gene23、Dsk2(dominant suppressor of Kar2、Ddi1(DNA damage molecule-1和Shp1/ p47。Rad23、Dsk2和Ddi1的UBL结构域能够直接与26S蛋白酶体相互作用,然而Shp1/p47的U

22、BX 结构域能够与Cdc48/p97相互作用,通过Cdc48/ p97与蛋白酶体联系在一起。目前多数的泛素化底物通过与RPN1/S2结合进入蛋白酶体。另外,泛素化的靶蛋白能够直接与RPN10/S5a和ATPase5 (RPT5/S6'/S6a结合。RPT5/S6'/S6a ATPase也能够与VHL E3s中的VHL结合,因此底物与蛋白酶体的结合有许多直接和间接的机制。这些不同的机制为多种蛋白在蛋白酶体中提供了选择性降解过程8。综上所述,RP辅助识别和伸展适当的底物,裂解与Ub连接的共价键,开放-环,然后伸展开的多肽直接进入CP的腔内被断裂成6-10个氨基酸长度的片断,最后在胞

23、浆中被水解成单个氨基酸。七、结语泛素-蛋白酶体途径是细胞内ATP依赖的蛋白质选择性降解的主要途径,是真核细胞内重要的蛋白质质控系统,参与细胞凋亡、MHC I类抗原的递呈、细胞周期以及细胞内信号转导等多种生理过程,对维持细胞的稳态具有十分重要的意义9。该途径在20世纪80年代初期首先被Avram Hershko、Aaron Ciechanover和Irwin Rose等几位科学家所认识,三人以此项成果共享2004年诺贝尔化学奖。经过30年的研究,人们对泛素-蛋白酶体途径的组成和在生物体内的功能有了深刻的认识,但是这远远还不够,还有许多问题未被阐明,如E3s的组成及是如何被调节的?多聚泛素链是如何

24、聚集的?细胞是如何操作让不同长度的泛素链修饰不同的蛋白质? 26S蛋白酶体RP各个亚基的功能是什么?泛素-蛋白酶体途径功能失常已经发现与多种疾病有重要的关系,已有研究显示针对失常的关键环节设计药物或基因的靶标,对疾病的治疗起到了良好的效果10。相信随着技术手段的进步,泛素-蛋白酶体途径会逐渐被揭示,从而丰富人们对人体生理状态的了解和对疾病的认识。参考文献1 Smalle J,Vierstra RD.The ubiquitin26S proteasome prote-olytic pathway.Annu Rev Plant Biol,2004,55"555 590.2 Robinson PA,Ardley HC.Ubiquitin-protein ligases.J CellSci,2004,117"51915194.3 Zheng N,Schulman BA,Song L,et al.Structure of theCul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2SCF ubiquitin ligase complex.Nature,2002,416"703709.4 Passmore LA,Booth CR,Venien-Bryan C,et al.Structuralanaly