EColi_感受态细胞的制备、质粒DNA的转化、提取与酶切鉴定

1、实验实验5454E.Coli E.Coli 感受态细胞的制备、质粒感受态细胞的制备、质粒DNADNA的转化、提取与酶切鉴定的转化、提取与酶切鉴定 制作人：刘如石制作人：刘如石一一. 实验目的和要求实验目的和要求 1、通过本实验了解和掌握氯化钙法制备大肠杆菌感通过本实验了解和掌握氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和质粒受态细胞和质粒DNADNA转化受体菌细胞的原理与技术；转化受体菌细胞的原理与技术；2 2、了解质粒了解质粒DNA的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒细胞中分离、提取质粒DNA的方法；的方法；3、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电、掌握

2、限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法；泳的操作方法； 通过本实验了解大肠杆菌感受态细胞制备、通过本实验了解大肠杆菌感受态细胞制备、DNA转化、限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作转化、限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作用。用。二二.实验原理实验原理 1 1、感受态细胞制备、感受态细胞制备: :所谓所谓感受态感受态是指受体细胞处是指受体细胞处于容易吸收外源于容易吸收外源DNADNA的一种生理状态，可以通过物理的一种生理状态，可以通过物理与化学方法诱导形成，也可以自然形成，在基因工与化学方法诱导形成，也可以自然形成，在基因工程技术中通常采用诱导的方法。用于转化的受体菌程技术

3、中通常采用诱导的方法。用于转化的受体菌细胞一般是细胞一般是限制限制- -修饰系统（修饰系统（Restriction-Restriction-ModificationModification）缺陷的变异株，以防止对导入的外缺陷的变异株，以防止对导入的外源源DNADNA的切割，用符号的切割，用符号R R- -M M- -表示。其基本原理是：细表示。其基本原理是：细菌处于菌处于00的的CaClCaCl2 2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒DNADNA形成形成抗抗DNaseDNase的羟基的羟基-

4、-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经经 (4) (4)、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，甚至切割的位点也相同，称为甚至切割的位点也相同，称为同裂酶同裂酶或或异源同工酶异源同工酶，如，如Hpa IIHpa II与与Msp IMsp I；有的识别位点不同，但对；有的识别位点不同，但对DNADNA切割后可产切割后可产生相同的粘性末端，称为生相同的粘性末端，称为同尾酶同尾酶，如，如BamHBamH I I与与BglBgl IIII。色，可确定色，可确定DNA在胶中的位置。在胶中的位置。 影响琼脂糖凝胶电泳影响琼脂糖凝胶电

5、泳DNADNA迁移率的因素：迁移率的因素： DNADNA的分子大小；的分子大小； 琼脂糖浓度；琼脂糖浓度； DNADNA构象；构象； 电场强度；电场强度； 碱基组成与温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。碱基组成与温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。 三实验材料与设备：三实验材料与设备：1 1、用品与与仪器：、用品与与仪器： 超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝离心机、旋涡震荡器、电泳

6、仪、电泳槽、紫外透射仪，凝胶成像仪、冰箱、制冰机等；胶成像仪、冰箱、制冰机等； 1.5mL 1.5mL 与与0.5mL Eppendorf 0.5mL Eppendorf 管、管、tiptip头头 、烧杯、量、烧杯、量筒筒四操作步骤四操作步骤: ( (一一) ) 感受态细胞的制备：感受态细胞的制备： 1 1、从新活化的、从新活化的E.coliE.coli DH5 DH5平板上挑取一平板上挑取一单菌落单菌落，接种于接种于3 35ml LB5ml LB液体培养中，液体培养中，3737振荡培养至对数生长振荡培养至对数生长期期( (12h左右左右) )； 2 2、将该菌悬液以、将该菌悬液以1:1001

7、:1001:501:50转接于转接于100ml LB100ml LB液体液体培养基中，培养基中，3737振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔后，每隔202030min30min测一次测一次ODOD600600，至，至ODOD600600为为0.30.30.50.5时停时停止培养，并转装到止培养，并转装到1.5 mL1.5 mL离心管中；离心管中； 3 3、培养物于冰上放置、培养物于冰上放置20min20min； 4 4、 0 044，4000g4000g离心离心10min10min，弃去上清液，加入，弃去上清液，加入1 1 mLmL冰冷的冰冷的0.1mo

8、10.1mo1L CaClL CaCl2 2溶液，小心悬浮细胞溶液，小心悬浮细胞, , 冰浴冰浴2020分钟；分钟；CaClCaCl2 2纯度至关重要，不同厂家，纯度至关重要，不同厂家，甚至同一厂家不同批号的产品均影响感受态的转化效率甚至同一厂家不同批号的产品均影响感受态的转化效率 5、04， 4000g离心离心10min，倒净上清培养液，倒净上清培养液，再用再用1.0 mL1.0 mL冰冷的冰冷的0.1mo10.1mo1L CaClL CaCl2 2溶液溶液轻轻悬浮轻轻悬浮细胞，细胞，冰浴冰浴20min20min； 6 6、 04， 4000g离心离心10min，弃去上清液，加入弃去上清液，

9、加入100 L100 L冰冷的冰冷的0.1mo10.1mo1L CaClL CaCl2 2溶液，溶液，小心悬浮细胞小心悬浮细胞，冰，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液； 8 8、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在如果在4 4放置放置1224h，其转化效率可以增高，其转化效率可以增高46倍倍；也可加入占总体积也可加入占总体积1515左右高压灭菌过的甘油，混匀后左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于分装于1.5ml1.5ml离心管中，置于离心管中，置于-70-70条件下，可保存半年条件下，可保存半年至一

10、年。至一年。（二）质粒（二）质粒DNADNA的转化：的转化： 1 1、每、每100L100L感受态细胞悬液中加入感受态细胞悬液中加入1L1L质粒质粒DNA,DNA,轻轻轻轻摇匀，同时设置三组对照：摇匀，同时设置三组对照：( (1)1)不加质粒，不加质粒，(2)不加受体不加受体菌，菌， (3)加已知具有转化活性的质粒加已知具有转化活性的质粒DNA，具体操作按具体操作按下表进行：下表进行：*阳性对照，用已知具有转化活性的pGEX-PDIP-r质粒DNA进行转化 五五. 实验结果报告：实验结果报告： 1、转化效率的计算、转化效率的计算 ： 转化子总数菌落数（转化反应原液总体积转化子总数菌落数（转化反应原液总体积/涂涂板菌液体积）板菌液体积） 转化