基因工程工具酶

1、 基基 因因 工工 程程工工 具具 酶酶基因工程工具酶基因工程工具酶 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNADNA进而降解非己进而降解非己DNADNA的防御工具。的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。最好的

2、基因工程工具。 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶( (如限制如限制性核酸内切酶，连接酶，性核酸内切酶，连接酶，DNADNA聚合酶等聚合酶等) )作为工具对基因进行人工切割，拼作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶工具酶”。工具酶是对野生菌株。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。 随着越来越多的酶分子被发现，许多厂商已将其克隆并开发成随着越来越多的酶分子被发现，许多

3、厂商已将其克隆并开发成产品，工具酶的数量和用途不断增加，不仅简化了分子克隆的操作，产品，工具酶的数量和用途不断增加，不仅简化了分子克隆的操作，而且拓宽了研究领域。而且拓宽了研究领域。 本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。基因工程工具酶基因工程工具酶 限制性内切酶 甲基化酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 磷酸激酶和磷酸酶 核酸酶 DNA连接酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction enzyme)(restriction enzyme)细菌的限制细菌的限制修饰作用和限制性内切酶的发现修饰作用和限制性内切酶的发现限制性内切酶的分类限制性内切酶的

4、分类限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名限制性内切酶的活性单位限制性内切酶的活性单位限制性内切酶的性质及切割特点限制性内切酶的性质及切割特点限制性内切酶的反应条件限制性内切酶的反应条件限制性内切酶的应用限制性内切酶的应用细菌的限制细菌的限制修饰作用和限制性内切酶的发现修饰作用和限制性内切酶的发现 1 1、细胞的限制、细胞的限制修饰作用修饰作用 5050年代后年代后LuriaLuria和和Human(1952) BertaniHuman(1952) Bertani和和Weigle(1953)Weigle(1953)发发现细菌的现细菌的“限制限制”现象：现象：Phage（k）感染感染E.coli

5、k不感染不感染E .coli B【E .coli B 限制限制 （k）】）】 仍有少量仍有少量(K)(K)可在可在 E.coliE.coli B B中生存，是因中生存，是因 E.coliE.coli B B对对(K)(K)进行进行了修饰。了修饰。E.coliE.coli B B修饰修饰(k)(k)* *(k)(k)感染感染E.coli(BE.coli(B) )细菌如何对细菌如何对噬菌体进行限制和修饰。噬菌体进行限制和修饰。2 2、细菌的限制、细菌的限制修饰系统修饰系统 19621962年年W.ArberW.Arber( (瑞士瑞士) )发现，寄主对噬菌体的修饰是在发现，寄主对噬菌体的修饰是在P

6、hagePhage入的入的DNADNA上。上。 19651965年，年，ArberArber发现修饰与发现修饰与的降解有关，提出：细胞中存在位点特的降解有关，提出：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制修饰系统。修饰系统。R-MR-M系统是细系统是细菌安内御外的积极措施。菌安内御外的积极措施。 3 3、限制性内切酶的发现、限制性内切酶的发现 19681968年年LinnLinn和和ArberArber从从E.coliE.coli B B中发现限制酶中发现限制酶,M.Meselson,M.Meselson和和R.yuanR.yuan从

7、从E.coliE.coli K K中分离到另一限制性的内切酶。中分离到另一限制性的内切酶。 1970 1970年年Smith (Smith (美美) )在流感嗜血杆菌又发现另一限制酶即限制酶在流感嗜血杆菌又发现另一限制酶即限制酶。 限制酶的功能：降解不同源限制酶的功能：降解不同源DNADNA，而不降解同源，而不降解同源DNADNA。 19781978年年W.ArberW.Arber、H.O.Smith(H.O.Smith(美美) )，NathansNathans( (美美) )因发现限制性内切因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金。酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金。

8、限制性内切酶的分类：限制性内切酶的分类： 目前已发现的限制酶有三大类：目前已发现的限制酶有三大类：类型 识别与切割位点分别，随意切割，相距较远，单链切割 相同 相距5-10bp功能(限制， 修饰)对基因工程意义防御，单功能不大 单功能 大 双功能(限制-修饰)不大限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名EcoR IEscherichia属名属名Coli种类种类Ry13株系株系编号编号 若种名头若种名头2 2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。三个字母。限制性内切酶的活性单位限制性内切酶的活性单位 50l Buffer50l Buffer中，含中，含

9、1g1g底物底物DNADNA，于最适反应条件和温度下，保，于最适反应条件和温度下，保温温1 1小时，能使小时，能使1g DNA1g DNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U U表示。（表示。（bufferbuffer：pH=8.0pH=8.0，50mmol/L Tris-HCl50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L MgCl10mmol/L MgCl2 2 ，1mmol/L DTT1mmol/L DTT或巯基乙醇，或巯基乙醇，100g BSA/ml100g BSA/ml）限制性内切酶的性质及切割特点限制性内切酶的性质及切割特点 1

10、1、裂解产物均具有、裂解产物均具有33羟基和羟基和55磷酸残基，磷酸残基，5P-N N5P-N NNNNNNN-OH 3NN-OH 3。 2 2、识别序列及切点的高度专一。、识别序列及切点的高度专一。E C O R I5 G A A T T C 33 C T T A A G 5BamH IG G A T C CC C T A G G3 3、有三种不同裂解方式：、有三种不同裂解方式： a. 平齐未端平齐未端环形环形DNA:如如 Hind 、Hpa、Sma、Alu、Hae。 .5?RCCC GGG 3. .3GGG CCC 5. 5?R CCC GGG 3 3 GGG CCC 5?R b. 5粘性

11、末端粘性末端 5?R G A A T T C 3 3 C T T A A G 5?R 5?RG 5A A T T C 3 3C T T A A 5 G 5?R 如如Ecolc. 3c. 3粘性末端粘性末端如如 PstPst 5?R C T G C A G 3 3 G A C G T C 5?R 5?R C T G C A G 3 3 G A C G T C 5?R 同裂酶同裂酶(isoschizomer)1. 1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种定义：能识别相同序列但来源不同的两种 或多种限制或多种限制 酶酶2. 2. 特点：特点：1 1）识别相同顺序）识别相同顺序 2 2）切割位点的异

12、同）切割位点的异同 KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstII CCGC GG SacII CCGC GG SmaI CCC GGG XmaI C CCGGG同同 尾尾 酶酶如：如：BamHI G GATCC BglII A GATCT MboI, Sau3AI N GATCN 上述几种限制酶产生的上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形片段仍可相连，由此形成的重组分子能被成的重组分子能被MboI和和Sau3AI识别和酶切，但识别和酶切，但BamHI和和BglII的识别机率只有的识别机率只有1/16。 BamHI + MboI A/C/G/T GATCT/C/G/

13、A BamHI和和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。相连后不能为两种酶所识别和酶切。 BamHI + BglII A/G GATCT/C限制性内切酶的反应条件限制性内切酶的反应条件 1 1、底物、底物 DNADNA a. DNA a. DNA 纯度纯度: RNA : RNA 与与 E E 结合影响有效酶浓度；结合影响有效酶浓度；RNARNA影响影响( (干扰干扰) )电泳区带。电泳区带。 b. DNAb. DNA浓度浓度: : DNADNA过大，会抑制酶活过大，会抑制酶活( (影响酶分子扩散影响酶分子扩散) )。 如：如：

14、4g DNA /1U HPa4g DNA /1U HPa 50l 50l 在在3737下下 15h15h 而而 1g DNA /1U HPa1g DNA /1U HPa 50l 50l 在在3737下下 1h1h c. c. 识别位点及邻近位点特异性序列识别位点及邻近位点特异性序列 由于切点邻近序列不同，水解速度不同。由于切点邻近序列不同，水解速度不同。如：如： DNADNA有有5 5个个ECORIECORI切点，其中两个相差切点，其中两个相差1010倍。倍。 pBR322 DNA pBR322 DNA 有有4 4个个NarNar切点切点(GGCGCC)(GGCGCC)其中其中2 2个切点用个

15、切点用1U1U酶水解酶水解1h1h完全完全切开切开,2,2个切点用个切点用50U50U酶水解酶水解16h16h水解不完全。水解不完全。 XmaXma切点是切点是CGGCCGCGGCCG，但在，但在GGGGCGGCCGCGGCCGCCCC时不切割时不切割 d. DNAd. DNA二级二级/ /三级结构三级结构 超螺旋超螺旋DNA(DNA(病毒或质粒病毒或质粒) )比线状比线状DNADNA需更多酶。需更多酶。 e. e. 提取时混入杂质可改变识别特异性提取时混入杂质可改变识别特异性 如：如： 高浓度高浓度HgHg2+2+、酚，氯仿、乙醇、酚，氯仿、乙醇、EDTA SDSEDTA SDS、NaClN

16、aCl等。等。 2 2、反应系统因素、反应系统因素 a. a. 缓冲液（无菌、无污染、配成核心缓冲液，即几种酶的相近缓冲液（无菌、无污染、配成核心缓冲液，即几种酶的相近bufferbuffer） b. b. 金属离子金属离子 如如型酶需型酶需MgMg2+2+，若以，若以MnMn2+2+代替代替MgMg2+2+（如（如HindHind，ECORIECORI）则特异性改变。）则特异性改变。 离子浓度，合适离子浓度，合适激发酶活；不合适激发酶活；不合适抑制酶活。抑制酶活。 c. c. 牛血清蛋白牛血清蛋白(BSA)(BSA) BSA BSA 是酶稳定剂，机制：减少蛋白酶及非特异性吸附作用。避免热、表

17、面是酶稳定剂，机制：减少蛋白酶及非特异性吸附作用。避免热、表面张力、化学品导致的酶变性。过量张力、化学品导致的酶变性。过量BSABSA会引起电泳拖尾。可通过加会引起电泳拖尾。可通过加SDS/65/5minSDS/65/5min除去。除去。 e. e. 水质：无离子水，水质：无离子水，ddHddH2 2O O，双蒸水。，双蒸水。 3 3、星活性、星活性 识别特异性放宽，如识别特异性放宽，如GAATTCAATTGAATTCAATT，为，为ECORIECORI。 造成星活性参数：造成星活性参数： 甘油浓度甘油浓度12-20%12-20%，酶与，酶与DNADNA比例，离子强度，比例，离子强度，45%4

18、5%聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)，有机溶，有机溶剂，剂，8%8%二甲基亚枫，二介阳离子，二甲基亚枫，二介阳离子，12%12%乙醇。乙醇。 星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。Lane 1:PUC 19质粒DNA Lane 2:经EcoR I 酶切的酶切产物 Lane 3:质粒经Pvu II 酶切产物Lane 4:质粒经Taq酶切产物质物M: Axygen 1Kb DNA LadderLane 1:质粒DNA Lane 2:经EcoR I 酶切的 酶切产物M: Axygen 1Kb DNA Ladder限制性内切酶的应用限制性内切酶的应用1

19、 1、重组、重组DNADNA前的切割前的切割 2 2、构建新质粒、构建新质粒3 3、构建物理图谱、构建物理图谱4 4、DNADNA分子杂交分子杂交 用限制性内切酶消化受体用限制性内切酶消化受体DNADNA 5 5、制备、制备DNADNA探针探针 6 6、亚克隆以用作序列分析、亚克隆以用作序列分析7 7、基因定位，、基因定位，DNADNA同源性研究。同源性研究。 1、大多数大多数 E.coliE.coli 中含有中含有两种两种可甲基化可甲基化DNADNA的酶的酶 dam dam 甲基化酶甲基化酶 Dcm Dcm 甲基化酶甲基化酶 dam dam 可将甲基引入可将甲基引入 GATC GATC 序列

20、中的腺嘌呤序列中的腺嘌呤N N6 6位。位。 dcmdcm 甲基化酶可将甲基引入甲基化酶可将甲基引入 CCA/TGG CCA/TGG 序列中的胞嘧啶残基甲基化。序列中的胞嘧啶残基甲基化。 甲基化酶甲基化酶 在在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。如：如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同不同 MHpaI C mCGG HpaI C CGG 相同相同2、制备细菌、制备细菌DNA

21、时，应注意时，应注意DNA在原细胞中的被修在原细胞中的被修饰，选用无限制系统细菌饰，选用无限制系统细菌(E.coli)或选用甲基化不敏感或选用甲基化不敏感的同裂酶。的同裂酶。3 3、用甲基化酶进行甲基化、用甲基化酶进行甲基化 a. a.对大多数对大多数型限制酶来说，都已分离出相应的甲基化酶型限制酶来说，都已分离出相应的甲基化酶(methylase(methylase) )。 b. b.甲基化酶也称修饰酶甲基化酶也称修饰酶(modification enzyme)(modification enzyme)已做为一种商品广泛应用。已做为一种商品广泛应用。 c. c.甲基化酶的用途甲基化酶的用途 1

22、) 1) 保护某些切点不被切割；保护某些切点不被切割；对甲基化敏感的限制性内切酶对甲基化敏感的限制性内切酶限制酶限制酶 识别序列识别序列* * 甲基化酶甲基化酶AvaAva GG(A/T)GG(A/T)CCCC(A/T)GG (A/T)GG dcmdcmBclBcl T TGATCGATCA A dam dam ClaCla G GATCATCGATGAT dam dam EcoEcoR R CC(A/T)GGCC(A/T)GG dcmdcmHphHph GGTGGTGAGATCTC dam damMboMbo GATCGATC dam damNruNru GAGATCTCGCGAGCGA d

23、am damSauSau96 96 GGNGGNCCCC(A/T)GG(A/T)GG dcmdcmSauSauF F CC(A/T)GGCC(A/T)GG dcmdcmStuStu AGGAGGCCTCCTGGGG dcmdcmTagTag GATCGATCGA damGA damXbaXba TCTATCTAGAGATCTC dam dam * *下横线字母表示限制酶识别序列下横线字母表示限制酶识别序列, , 绿色字母表示绿色字母表示damdam甲基化酶识别序列甲基化酶识别序列, ,红色红色字母表示字母表示dcmdcm甲基化酶识别序列甲基化酶识别序列 2) 2) 配合连接子的使用，建立配合连

24、接子的使用，建立DNADNA片段粘性末端；片段粘性末端； 在建立基因文库时，可先使在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切分子部分甲基化，然后再用限制酶切M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3与载体相连与载体相连甲基甲基化酶化酶人工人工接头接头RE用于基因组文库的建立用于基因组文库的建立用于用于cDNA的连接的连接RERERE DPNI DPNI是唯一识别是唯一识别GAGAm6m6TCTC的限制酶，而不降解的限制酶，而不降解GATCGATC。 M.Taq1 M.Taq1可使可使TCGATCGA甲基化甲基化TCGATCGAm

25、6m6 TCGA + TCGA TCGA + TCGA 或或DNADNA中的中的 TCGATCGATCGATCGA序列。序列。连接酶连接酶TCGATCGATCGATCGA M.TaqlM.Taql TCTCGAGAm6m6TCTCGAGAm6m6DPNIDPNI切点切点 3) 3) 构建新的酶切位点构建新的酶切位点 如：如： 4)4)封闭封闭DNADNA链中某些识别位点，交叉保护通过修饰封闭多余的限制性切点。链中某些识别位点，交叉保护通过修饰封闭多余的限制性切点。 如：一段如：一段DNADNA有二个有二个BamHIBamHI识别位点，其中一个识别位点，其中一个BamHIBamHI与修饰位点重叠

26、与修饰位点重叠 可通过修饰将此位点封闭。可通过修饰将此位点封闭。 DNA DNA聚合酶：指在聚合酶：指在DNA(DNA(或或RNA)RNA)模板指导下，以模板指导下，以4 4种种dNTPdNTP为底物，在引物为底物，在引物3 3 OH OH末端聚合末端聚合DNADNA链的一类酶。链的一类酶。 特点：特点： 需模板需模板(DNA(DNA或或RNA)RNA)； 需引物；需引物； 聚合方向聚合方向5353； 同时具有同时具有3535和外切和外切5353外切作用。外切作用。DNA聚合酶聚合酶种类：种类： 目前已发现的和已开发的此类酶有以下几种：目前已发现的和已开发的此类酶有以下几种： DNADNA聚合

27、酶聚合酶(全酶全酶)(E.coli)(E.coli) ) KlenowKlenow片段片段(E.coli(E.coli) ) T TDNADNA聚合酶聚合酶(T(TPhagePhage感染的感染的E.coliE.coli) ) T TDNADNA聚合酶聚合酶(T(TPhagePhage感染的感染的E.coliE.coli) ) 修饰的修饰的T TDNADNA聚合酶聚合酶( (测序酶测序酶) ) TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶( (耐热耐热)(Thermusaqraticus)(Thermusaqraticus) ) DNADNA末端转移酶末端转移酶( (小牛胸腺小牛胸腺) ) 反转录酶反

28、转录酶( (依赖依赖RNA)RNA)聚合酶聚合酶 - -为依赖为依赖DNADNA的的DNADNA聚合酶聚合酶 为不依赖为不依赖DNADNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。 为依赖为依赖RNARNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。活性与用途活性与用途 1 1、 E.coli DNA聚合酶聚合酶I（polI） 来源：来源：E.coliE.coli，由染色体，由染色体DNADNA基因编码。商品上用的此酶来源于基因编码。商品上用的此酶来源于Phage NM964Phage NM964整合的溶源性整合的溶源性E.coliE.coli。结构：一条多肽链，结构：一条多肽链，MW = 109MW = 109，

29、000 D000 D。具两种外切酶活性和具两种外切酶活性和DNA聚合酶聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，大片段具外切酶活性，大片段具35外切酶活性外切酶活性(大片段亦称为大片段亦称为Klenow片段片段, polIK)聚合酶活性，聚合酶活性，53, 要求要求3-OH引物和模板引物和模板DNA，其延续性受反应条，其延续性受反应条件的影响件的影响E.coli DNA PolI 的延续性的延续性 DNA模板模板-引物类型引物类型 反应条件反应条件 延续性延续性(碱基数碱基数) 切口切口

30、 ColE1 37C, 低盐低盐 8 缺口缺口 ColE1 37C, 低盐低盐 47 切口切口/缺口胸腺缺口胸腺DNA 37C, 低盐低盐 24 poly) 5C, 低盐低盐 14 poly d(AT d(AT) 37C, 低盐低盐 188 poly d(AT) 5C, 高盐高盐 3用用 途途1） 除去除去3-端突起的单链端突起的单链DNA（在无（在无dNTP时）时）2） 补齐补齐5-突起端突起端3） 合成第二条合成第二条cDNA4） 切口移位制备探针切口移位制备探针 其中用途其中用途2) 和和3)常用大片段常用大片段 来源：来源：E.coliE.coli DNA Polymerase DNA

31、 Polymerase经蛋白酶水解的大片段经蛋白酶水解的大片段(Klenow(Klenow和和Henningseon.1970)Henningseon.1970)DNApolymerasel枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶或胰蛋白酶C 端端76，000 dKlenow活性活性 聚聚合合 5外切外切N 端端36，000 5外切外切 Jacobsen(1974),Joyce Jacobsen(1974),Joyce 和和 Grindley,(1983)Grindley,(1983)克隆此大片段。克隆此大片段。 2. klenow(E.coli)用途：用途： 填补限制酶的填补限制酶的5-5-粘

32、性末端为平齐末端：粘性末端为平齐末端： C C C C G G A A T TKlenow C C T T A A G G A A T T 末端标记末端标记 a. 平齐末端中用（平齐末端中用（-32p) dNTP , 底物可标记底物可标记 末端末端 b. 对于对于粘性末端粘性末端 A A G G C C T T A A T T C C G G 外切外切 外切外切无底物时无底物时Klenow A A TT C C G G 4 种种Dnap+ - 32p dNTPKlenow A A G G C C T T C C G G Klenow 在无底物时只进行在无底物时只进行 外切；有底物存在时则聚合。

33、外切；有底物存在时则聚合。 以上也称作交换标记，但此作用不如以上也称作交换标记，但此作用不如T4DNA聚合酶。聚合酶。在在cDNA克隆中合成克隆中合成cDNA第二链。第二链。RNA逆转录逆转录RNAcDNARnase HSS cDNAKlenowds cDNA DNADNA测序测序末端终止法末端终止法(Sanger 1977)(Sanger 1977) 通过通过3535外切，平齐限制酶切产生的外切，平齐限制酶切产生的33粘性末端粘性末端( (现在多用现在多用T TDNA DNA polymersasepolymersase) ) 最早用于最早用于PCRPCR聚合反应，现已用聚合反应，现已用Ta

34、qTaq酶取代。酶取代。3 3、T T4 4DNADNA聚合酶聚合酶 来源：来源： T T4 4PhagePhage感染的感染的E.coliE.coli结构：结构：MW=114000dMW=114000d活性：活性： 53 53聚合反应；聚合反应； 35 35外切活性对单链活性大于双链外切活性对单链活性大于双链DNADNA，外切酶活性比，外切酶活性比KlenowKlenow大大200200倍。倍。用途：用途：5533补齐或末端标记，补齐或末端标记，同于同于Klenow 3- 3-粘性末端的标记制备粘性末端的标记制备DNADNA探针探针, ,同同 KlenowKlenow 末端标记末端标记b b

35、。延伸结合于单链延伸结合于单链DNADNA模板上的诱变寡核苷酸引物。模板上的诱变寡核苷酸引物。D诱变引物诱变引物T T4 4 DNA聚合酶聚合酶诱变诱变DNA5533 填补或标记限制酶切后产生的填补或标记限制酶切后产生的5-粘性末端的粘性末端的3-凹缺末端。凹缺末端。 外切酶活性外切酶活性 聚合酶活性聚合酶活性 无无dNTP dNTP4 4、T T7 7DNADNA聚合酶（测序酶）聚合酶（测序酶） 来源：来源：T T7 7PhagePhage感染的感染的E.coliE.coli 结构：结构：由由2 2个蛋白亚基组成：个蛋白亚基组成：a.Ta.T7 7phage gene5phage gene5

36、蛋白、外切蛋白、外切 3535末端末端 b. b. 宿主硫氧蛋白宿主硫氧蛋白活性：活性：5353聚合，在所有聚合，在所有DNADNA聚合酶中持续反应时间最长，所以合成聚合酶中持续反应时间最长，所以合成 的的DNADNA链长。故在链长。故在DNADNA测序中有很大优越性测序中有很大优越性 35 35外切活力外切活力(T(TPhage gene5Phage gene5编码编码) )是是DNA DNA 聚合酶聚合酶I I的的 10001000倍。倍。用途：用途： 复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列 用填补或交换反应快速进行末端标记。用填补或交换反应快速进

37、行末端标记。55333355与与T TDNApolDNApol一样，平齐粘性末端。一样，平齐粘性末端。定点突变中互补链的合成。定点突变中互补链的合成。5 5、修饰的、修饰的 T T7 7DNA DNA 聚合酶聚合酶( (测序酶测序酶) )来源：来源：天然天然 T TDNAPolymeraseDNAPolymerase 经修饰处理。经修饰处理。结构：结构：同同T T聚合酶，用还原剂、分子氧、低浓度聚合酶，用还原剂、分子氧、低浓度 FeFe与酶保温几天，与酶保温几天，可使可使PhageTPhageT7 7 gene5gene5蛋白蛋白N-N-端端3535外切酶活性中心失活外切酶活性中心失活(O(O

38、- - 修修饰饰) )。即：即：5353聚合酶作用提高，持续性长。聚合酶作用提高，持续性长。3 53 5外切作用下外切作用下降降99%99%以上。以上。已用基因工程方法生产出改进的测序酶已用基因工程方法生产出改进的测序酶2.02.0其已完全无外切酶活性。其已完全无外切酶活性。用途：用途：DNADNA序列分析，可读出较长的序列。序列分析，可读出较长的序列。聚合能力高，可有效地将低水平聚合能力高，可有效地将低水平dNTPdNTP( (0.1mol/L)0.1mol/L)掺入到被掺入到被标记底物中。标记底物中。 填补末端标记填补末端标记5-5-粘性末端的粘性末端的33端。端。6 6、TaqTaq D

39、NA DNA 聚合酶聚合酶(Thermusaqraticus(Thermusaqraticus) ) 来源：来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种。从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种。结构：结构：单亚基单亚基MW=94000dMW=94000d。活性：活性：聚合最适温度为聚合最适温度为75-8075-80，不具，不具3535外切酶活性，具外切酶活性，具5353外切。外切。用途：用途： PCR PCR反应；反应； 测序，高温下进行测序，高温下进行DNADNA合成可减少模板二级结构。合成可减少模板二级结构。 5 3 变性变性 3 5 5 3 引物引物 3 5 复性复性 5 3 5 3 3 5

40、 引物引物 3 5 5 3 延伸延伸 5 3 3 5 3 5 7 7、末端转移酶、末端转移酶( (不依赖模板的不依赖模板的DNADNA聚合酶聚合酶) )来源：来源：是一种只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在的罕见的是一种只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在的罕见的DNADNA聚合酶聚合酶(Chang(Chang和和Bollum,1986)Bollum,1986)。 结构：结构：MW=60MW=60，000d.000d.活性：活性： 催化催化dNTPdNTP掺入掺入DNA 3-DNA 3-羟末端，形成同聚物末端羟末端，形成同聚物末端 反应不需模板反应不需模板DNADNA，需，需CoC

41、o2+2+。用途：用途： 克隆克隆DNADNA片段时加上互补同聚物末端，便于与载体连接。片段时加上互补同聚物末端，便于与载体连接。 末端标记末端标记切平反应和补平反应切平反应和补平反应 5AAGCTT3 HindIII 5A AGCTT3 3TTCGAA5 3TTCGA A5 S1 dNTP+ klenow frag 5A T3 5AAGCT AGCTT3 3T A5 3TTCGA TCGAA5 T4 DNA连接酶连接酶 T4 DNA连接酶连接酶 5AT3 5AAGCTAGCTT3 3TA5 3TTCGATCGAA5四种不同补平反应四种不同补平反应5-GGATCC-3 BamHI 5-G GA

42、TCC-33-CCTAGG-5 3-CCTAG G-5 dNTP dGTP dGTP/dATP dGTP/dATP/dTTP5-GGATC 5-GG 5-GGA 5-GGAT 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG GATCC-3 GATCC-3 GATCC-3 GATCC-3 CTAGG-5 GG-5 AGG-5 TAGG-5 I S1 S1 S1 5-GG CC-3 5-GGA TCC-3 5-GGAT ATCC-3 3-CC GG-5 3-CCT AGG-5 3-CCTA TAGG-5 II III 8 8、反转录酶、反转录酶 来源：商品反转录酶有两种来源：商品反

43、转录酶有两种来自禽类成髓细胞瘤病毒来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)(AMV)。来自能表达来自能表达MoloneyMoloney鼠白血病毒鼠白血病毒(M-MLV)(M-MLV)反转录酶基因的反转录酶基因的E.coliE.coli。结构和活性：结构和活性：结构和活性：酶类别肽链53聚合活性RNaseHAMV2 条 :62000 :94000+M-MLV1 条 84000+合成长合成长cDNAcDNA M-MLV M-MLV优于优于AMV.AMV.均无均无3535核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。用途：用途： 合成合成cDNAcDNA克隆至载体中；克隆至载体中；粘性末端补平、标记；粘性末端补平、标记；

44、双脱氧测序时，如用其它酶效果不好，可使用反转录酶。双脱氧测序时，如用其它酶效果不好，可使用反转录酶。RNA RNA 聚合酶聚合酶1 1、RNARNA聚合酶聚合酶 来源：商品酶为来源：商品酶为T T7 7、T T3 3RNA RNA 聚合酶在聚合酶在E.coliE.coli中的克隆表达。中的克隆表达。T T7 7、T T3 3、RNA RNA 聚合酶在酵母中的克隆表达。聚合酶在酵母中的克隆表达。E.coliE.coli RNA RNA聚合酶。聚合酶。酶活：酶活：DNADNA指导下的指导下的RNARNA合成，结合于启动子部位。转录无意义链合成，结合于启动子部位。转录无意义链( (一一) )产生与有

45、意产生与有意义链相似义链相似( (以以U U代替模板中代替模板中T)T)的链。的链。转录链为无意义链，负链转录链为无意义链，负链(-)(-)。不转录链为有意义链，正链不转录链为有意义链，正链(+)(+)2 2、多聚、多聚(A)(A)聚合酶聚合酶(E.coli(E.coli) ) 结构：结构： MW=58000MW=58000，一条多肽链。，一条多肽链。活性：活性：催化催化RNA 3RNA 3末端加末端加AMPAMP。用途：用途：在在RNA 3RNA 3末端加末端加Poly(A)Poly(A)，以合成，以合成cDNA(GethincDNA(Gethin等等.1980).1980)。用用3232P

46、ATPPATP标记标记RNA 3RNA 3末端。末端。3 3、鸟苷酸转移酶、鸟苷酸转移酶(Guanylytransferase(Guanylytransferase) )来源：来源：牛痘病毒。牛痘病毒。活性：活性：催化催化GTPGTP转移转移GMPGMP至至55PPPPPPRNARNA的的 55末端。末端。55PPP-RNA + PPP-RNA + GTP GTP 或或55PPRNAPPRNA。ppippiG G55PPPPPP55NRNANRNA用途：用途： 体外转录体外转录RNARNA产物加帽。产物加帽。磷酸激酶和磷酸酶磷酸激酶和磷酸酶 磷酸激酶和磷酸酶分别催化核酸磷酸激酶和磷酸酶分别催化

47、核酸 5-OH 5-OH 加加 P P 和去除和去除 5- P 5- P ： 5p A T T A G C 5p A T T A G C C C G C C G T A A T C G T A A T C G G G C p 5 G G C p 5PNKasePMase 5HO A T T A G C 5HO A T T A G C C C G C C G T A A T C G T A A T C G G G C OH 5 G G C OH 5多核苷酸激酶多核苷酸激酶磷酸甲酯酶磷酸甲酯酶Phosphomonoesterase 应用：应用： 标记标记 5-5-末端。末端。 基因重组中，酶切后先

48、去掉基因重组中，酶切后先去掉5P5P，以防止自身重组，以防止自身重组( (连接连接) )，以提，以提 高重组效率。高重组效率。 重组前磷酸化。重组前磷酸化。商品酶：商品酶： T T4 4多核苷酸激酶多核苷酸激酶T T4 4Polynucleotide kinasePolynucleotide kinase碱性磷酸酶碱性磷酸酶(alkaline phosphatase(alkaline phosphatase) )牛肠碱性磷酸酶牛肠碱性磷酸酶(BAP)(BAP)大肠杆菌磷酸酶大肠杆菌磷酸酶(ClP(ClP) ) -32PATP ATP 5 P OH 3 5 32P OH 33HO P 5 3 H

49、O 32P 5 I II 5 P OH3 5HO OH3 5 P OH 3 3HO P 5 3HO OH5 3HO P 5 磷酸酶磷酸酶(I)与磷酸激酶与磷酸激酶(II)活性活性 磷酸激酶的交换反应磷酸激酶的交换反应核酸酶核酸酶外切核酸酶外切核酸酶内切核酸酶内切核酸酶核糖核酸酶核糖核酸酶ds-DNA结构结构: 切口切口, 缺口缺口, 断口断口缺口缺口(gap) 切口切口(nick) 断口断口(cut)3HO P53HO P5 外切核酸酶外切核酸酶单链单链 5 35 3和和 3 53 5外切核酸酶。外切核酸酶。外切核酸酶外切核酸酶(exov(exov) ) 。exovexov NMP5 35 3

50、DNA应用：应用： 基因组基因组DNADNA中内含子的位置作图。中内含子的位置作图。切除通过切除通过Poly(dA-dTPoly(dA-dT) )加尾插入到质粒载体中的加尾插入到质粒载体中的DNADNA片段。片段。双链双链5 35 3末端外切酶末端外切酶 1. 1. 入入PhagePhage外切核酸酶外切核酸酶( (入入exoexo) ) 降解降解 5-P5-P的核苷酸，不降解的核苷酸，不降解 5-OH5-OH核苷酸。如降解核苷酸。如降解 PNNNNPNNNN, ,不降不降解解 HONNNHONNN55dsDNAP 555533ssDNA应用：应用： 在双脱氧测序时，将在双脱氧测序时，将dsD

51、NAssDNAdsDNAssDNA。 平齐平齐5-5-粘性末端，便于末端转移酶加尾。粘性末端，便于末端转移酶加尾。2. T2. T7 7 基因基因6 6外切核酸酶外切核酸酶应用：应用： 降解降解5-P DNA5-P DNA末端，也可降解末端，也可降解5-OH5-OH末端末端, ,与其它酶一起使与其它酶一起使DNADNA链链变短。变短。双链双链3535外切酶外切酶外切核酸酶外切核酸酶(exo(exo)55333355exoexo5555 NMP32pNTPKlenow放射性探针放射性探针应用：应用： 制备链特异性探针。制备链特异性探针。制备制备SSDNASSDNA用于双脱氧测序做为模板。用于双脱

52、氧测序做为模板。内切核酸酶内切核酸酶Bal 核酸酶核酸酶 同时具有内切酶活性的外切酶，也可降解同时具有内切酶活性的外切酶，也可降解RNA。既具有单链特异性，同时具有。既具有单链特异性，同时具有 双链特异性。双链特异性。Bal31 活性需活性需Ca2+，也需，也需Mg2+，反应液中加入，反应液中加入EDTA，便可终止，便可终止Ca2+ 活活性，而不改变性，而不改变Mg2+ 浓度，所以在终止浓度，所以在终止Bal31下不影响限制性酶活性。下不影响限制性酶活性。EDTA55 dNMP 或或 rNMPa.ssDNA 或或 RNA55EDTA5533335555333355b.已知已知 DNA 或或 R

53、NAc.水解水解 dsDNA 末端末端EDTAS1 核酸酶核酸酶对对 SSDNA SSDNA 有高度特异性。有高度特异性。S1绿豆核酸酶与绿豆核酸酶与S1S1类似类似ExoIIIS1S1S1S1S1S1Poly(A)Poly(A)555555核酸酶核酸酶S1活性活性 5PP53HOOH3核酸酶核酸酶Bal31的活性的活性DNaseDNase 1 1、来源：、来源： 牛胰牛胰2 2、结构：、结构： MW=37KD MW=37KD 为为- -糖蛋白糖蛋白3 3、活性：、活性：水解位点：优先水解嘧啶水解位点：优先水解嘧啶5P5P与一个核苷核与一个核苷核的磷酸二酯键位点。的磷酸二酯键位点。A A P

54、P G G P P C C P P T T P P C C P P G G P P T T P P A A OHOH MgMg2+2+存在下，随机切割存在下，随机切割DNADNA双链中的任一条。双链中的任一条。MnMn2+2+存在时，切割双链。存在时，切割双链。无无RNaseRNase活性的活性的DNaseDNase处理：处理：DNase/0.1molDNase/0.1mol碘乙酸，碘乙酸，0.15mol0.15mol乙酸钠乙酸钠(pH5.3)55(pH5.3)55加热加热40min40min，+1molCaCl+1molCaCl2 2至至5mmol5mmol。4 4、用途：、用途： 切口平移

55、时切口产生。切口平移时切口产生。裂解双链裂解双链DNA(MnDNA(Mn2+2+）。）。 Mn+存在时存在时 Mg+存在时存在时 DNaseI作用特点作用特点DNaseI HO P5 35 35 3DNaseI与与Pol I 的的切口移位切口移位Pol I核糖核酸酶核糖核酸酶RNaseARNaseA 1 1、来源：、来源： 牛胰牛胰2 2、活性：、活性： RNARNA内切酶内切酶 无无DNaseDNase的的RnaseRnase处理：处理：用用TE(Tris-HClTE(Tris-HCl) )溶解后溶解后(1mg/ml)(1mg/ml)煮沸煮沸10-30min10-30min，分小份存，分小份

56、存2020。3 3、应用：、应用：A p U p G p C p G p A p U p C抑制：抑制：人类胚胎特异性抑制剂人类胚胎特异性抑制剂 Rnasin，钒氧核苷酸复合物。用蛋白，钒氧核苷酸复合物。用蛋白酶处理可除去酶处理可除去RNaseA。 在制备在制备DNADNA中除去中除去RNARNA。 RNA RNA测序。测序。 除去除去DNA-RNADNA-RNA杂交链中的杂交链中的RNARNA。RNaseRNase H H来源：来源：E.coliE.coli活性：活性： RNA RNA 内切酶降解内切酶降解 RNA-DNA RNA-DNA 杂交链中的杂交链中的 RNA RNA 链。链。应用：

57、应用：降解降解RNA-DNARNA-DNA中的中的mRNAmRNA，利于，利于cDNAcDNA第二链合成。第二链合成。RAaseRAase T T1 1来源：来源： 米曲霉米曲霉活性：活性： 内切酶，特异降解内切酶，特异降解G G残基后的残基后的- -磷酸二酯键。磷酸二酯键。应用：应用： RNA RNA 测序测序A p U p G p C p C p U p A 中间产物无环化的单核苷酸。中间产物无环化的单核苷酸。连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶 连接连接DNADNA末端，可连接平齐末端，所需酶是粘性末端连接的末端，可连接平齐末端，所需酶是粘性末端连接的10-10010-100

58、倍。倍。酶活单位用酶活单位用WeissWeiss1Weiss1Weiss单位单位=60=60个粘性末端单位个粘性末端单位E.coliE.coli连接酶连接酶活性：活性： 与与 T T4 4DNA DNA 连接酶同，但不连接平齐末端。在非平端连接时，连接酶同，但不连接平齐末端。在非平端连接时，可代替可代替 T T4 4DNALigase DNALigase 。酶活单位用酶活单位用Modrich-lehmanModrich-lehman1Modrich-lehman=61Modrich-lehman=6个个WeissWeissRNA RNA 连接酶连接酶T T4 4RNA RNA 连接酶连接酶活性

59、：活性： 在在ATPATP存在下，可催化单链存在下，可催化单链DNADNA或或RNARNA连接。连接。应用：应用： RNA3 RNA3末端放射性标记。末端放射性标记。 增加增加 T T4 4DNA ligaseDNA ligase 的平端连接活性。的平端连接活性。练练 习习 题题1. 一种一种DNA分子经三种限制酶完全酶切后得如下结果：分子经三种限制酶完全酶切后得如下结果： EcoRI 5kb EcoRI/HindIII 1、2、3、4kb HindIII 3kb 、7kb EcoRI/PstI 2、3、5kb PstI 10kb HindIII/PstI 1、3、6kb 将各限制酶位点绘制在

60、将各限制酶位点绘制在DNA分子上。分子上。 2. 另一另一DNA分子经相同处理后得如下结果，将各限制酶位点标在分子经相同处理后得如下结果，将各限制酶位点标在DNA分子上。分子上。 EcoRI 1、3、6kb EcoRI/HindIII 1、3kb HindIII 4、6kb EcoRI/PstI 1、3、5kb PstI 2、8kb HindIII/PstI 2、6kb 3.下图中的一段下图中的一段DNA分子上有两个限制酶分子上有两个限制酶PstI和和EcoRI识别位点，两位点相距识别位点，两位点相距10bp，现有一研究生要分析，现有一研究生要分析EcoRI右侧右侧500bp区域内的功能，他需