西华师范大学生命科学院

1、西华师范大学生命科学院遗传学实验教学大纲王祖秀20072一 教学目的与要求 遗传学为生物学各专业的必修基础课之一。 本课程主要通过动物、植物、微生物为材料，从个体、细胞、分子水平揭示遗传学的基本现象与规律。通过遗传学实验，使学生加深对遗传学基本原理的理解。同时使学生熟练掌握经典遗传学的研究方法与技术。学习和掌握部分现代遗传学的实验操作与技能，熟悉遗传学的分析方法，培养学生分析问题的能力。 本实验课内容主要包括验证性实验和综合性实验。全部实验均在教师指导下，由学生自己动手完成。显微镜观察内容，均采用显微镜示范和显微图片示范相结合的方式。使学生能高效、准确地识别观察内容。对实验结果不成功的学生，要

2、求分析其原因。二 遗传学实验及学时分配(实验总学时34)实 验 名 称学时数实验一植物有丝分裂的制片与观察2实验二人体染色体核型分析及辐射诱变染色体畸变的观察2实验三大葱减数分裂的制片与观察3实验四果蝇形态、性状、性别、生活史的观察及杂交实验技术 2实验五果蝇唾腺染色体制片与观察3实验六小鼠骨髓细胞染色体制片与观察 4实验七动物染色体分带技术3实验八植物基因组DNA的提取（创新实验）4实验九DNA的凝胶电泳（创新实验）4实验十随机扩增多态DNA（RAPD）技术（创新实验）5实验十一人群中P.T.C味盲及ABO血型基因频率的分析2 三 教学内容 实验一 植物有丝分裂的制片与观察(一) 实验原理

3、在各种生长旺盛的植物组织中，包括：孢原组织、根尖、茎尖以及愈伤组织、分化的小孢子、萌发的花粉管，常进行着细胞分裂。经过适当的取材处理，加以固定、离析、染色、涂抹压片，可以迅速的将细胞分散附着在载玻片与盖片之间。然后进行有丝分裂过程中染色体动态变化的观察。遗传学上，通过细胞有丝分裂的观察研究染色体的形态、结构和计数，是进行核型分析、鉴别杂种等常驻机构用的基本方法。(二) 实验目的 1观察染色体在有丝分裂中的动态变化过程，识别有丝分裂各个时期特点，加深对有丝分裂遗传学意义的理解。 2 学习和掌握对植物组织、细胞的固定、离析和观察植物根尖有丝分裂的压片方法。(三) 实验材料 蚕豆(四) 实验器具与试

4、剂 1 器具 恒温水浴箱、显微镜、载玻片、盖玻片、50ml烧杯、镊子、刀片、铅笔、吸水纸、擦镜纸 2 试剂 95%乙醇、冰醋酸、1NHCl、改良苯酚品红(五) 实验步骤 1 取材 用刀片切取0.51.0cm的蚕豆侧根根尖; 2 固定 取下的根尖用3:1的乙醇冰醋酸卡诺氏固定液固定30分钟; 3 解离 酸解法1) 将材料水洗吸干后,放入60的1NHCl中解离8分钟,用水充分漂洗后制片。解离的目的是软化细胞,使细胞便于分散。 酸解法2） 将材料放入95%乙醇：浓HCl= 1：1的解离液中在室温下解离8分钟, 用水充分漂洗后制片。 4 染色压片 将漂洗后的根尖置于载片中央，用刀片切取分生区细胞少许，

5、滴上一滴染液，盖上盖片，染色1015分钟。用铅笔头轻轻敲打盖片，使细胞分散。 （六） 观察与绘制有丝分裂各时期图实验二 人体染色体核型分析(一) 实验原理 任何一种生物的细胞都有一定数目、一定大小和形态的染色体，便构成了生物体特有的核型。核型是指染色体组在有丝分裂中期的表型。包括染色体的数目、大小和形态的总和。不同的生物，其核型是不同的。核型分析是在对有丝分裂中期染色体进行测量、计算的基础上，进行配对，按一定原则编号（从大到小）、分组、排列，并进行形态分析的过程。核型分析可以为细胞遗传分类、物种间亲缘的关系、以及染色体数目和结构变异的研究提供重要依据。因此，在细胞遗传研究领域中具有重要意义。

6、(二) 实验目的 了解核型分析的过程，学习核型分析的方法。(三) 实验材料 正常男人、正常女人的染色体照片(四) 实验器具 毫米尺、计算器、剪刀、镊子、胶水（制作染色体标本片的器具见人体外周血培养技术，摄影显微镜、放大机、相纸、暗室设备等。）（五） 实验步骤1 正常男人、正常女人的染色体标本片显微观察选染色体形态好、分散好、且完整的细胞进行显微摄影冲洗胶卷放大成照片（教师准备）2 对照片上分散的染色体随机编号，测量、记录每条染色体的长臂、短臂、臂比、全长和相对长度。相对长度=每条染色体的长度/单倍染色体组长度（2n总长度/2）X100臂比=长臂长度/短臂长度（q/p）3 配对 根据测定的每条染

7、色体的相对长度和臂比，将大小和形态相近的两条染色体配对成一对同源染色体。4 分类和排序染色体的分类根据Levan（1964）的分类标准，根据臂比大小不同分成：m、sm、st、t四类。根据相对长度的大小，将配对后的染色体从大到小编号排序。附人类正常男人的核型图:人体染色体核型分析数据表染色体编号相对长度长臂短臂臂比染色体类型染色体编号相对长度长臂短臂臂比染色体类型113214315416517618719820921102211X12Y实验三 大葱减数分裂的制片与观察 (一) 实验原理 进行有性繁殖的生物,都要通过减数分裂形成配子。减数分裂过程中，染色体复制一次，细胞连续分裂两次。因此，通过减数

8、分裂形成的配子中的染色体数目减半。由2N变成N。减数分裂过程中，染色体要发生一系列的变化。在适当时机采集植物花蕾，经固定后，取花蕾中的花药制片，就可在显微镜下观察到染色体在减数分裂中的行为和变化过程。(二) 实验目的 1 观察染色体在减数分裂中的行为和变化过程，识别减数分裂各个时期特点，加深对减数分裂遗传学意义的理解； 2 掌握观察植物减数分裂的制片技术。(三) 实验材料 大葱花序(四) 实验器具与试剂 1 器具 显微镜、载玻片、盖玻片、解剖针、镊子、吸水纸、擦镜纸 2 试剂 95%乙醇、冰醋酸、改良苯酚品红(五) 实验步骤 1 取材：在2-3月份，摘取1.52.0cm大小的大葱花序;2 固定

9、: 取下大葱花序用3:1的乙醇冰醋酸卡诺氏固定液固定24小时后转入70%的酒精中保存.3 制片: 取大小适当的花蕾,用解剖针剥出花药,将花药置于载片中央,滴上一滴染液,用镊子挟破花药,挤出花粉母细胞，除去大块杂质，盖上盖片。(六) 观察并绘制大葱减数分裂各时期细胞图实验四 果蝇形态、性状、性别、生活史的观察及杂交实验技术(一) 实验原理 果蝇是双翅目昆虫,它具有生活周期短（25培养，两周一个世代，）；繁殖力强（每只雌果蝇一生中可产400只卵）、数量大；个体小、易培养；可见形态突变性状多等优点，因此，果蝇是用作遗传实验极好的材料。后来还发现果蝇不仅染色体数目少，2N=8，还具有巨型的唾腺染色体，

10、是进行细胞遗传研究的极好材料。因此，对果蝇形态及生活史的了解具有重要意义。(二) 实验目的 1观察果蝇生活史中各个阶段形态特征,掌握果蝇培养条件和培养基的制备； 2 正确区分果蝇雌雄和几种常见的突变性状； 3 掌握观察果蝇性状的麻醉技术;4 进行果蝇杂交实验的实验步骤及注意事项。(三) 实验材料 5个果蝇品种(四) 实验内容 1 观察果蝇生活史： 全变态昆虫： 卵 幼虫 蛹 成虫 培养温度对生活周期长短的影响 培养温度 10 15 20 25 卵 幼虫： 8天 5天 幼虫成虫： 57天 18天 6天 4天 2 雌雄性别的鉴别区别雌性雄性1）体大体小；2）腹部椭圆、末端稍尖；腹部末端钝圆；3）成

11、虫腹部背面有5条黑色细条纹；成虫腹部背面有2细1粗的3黑条纹；4）腹部腹面有6个腹片腹部腹面有4个腹片5）第一对胸足附节基部无性梳第一对胸足附节基部有性梳6）肛上板简单（白色）肛上板复杂（褐色） 附: 野生型果蝇图 雄性() 雌性()3 常见的几种突变性状 野生型： 长翅（+） 红眼（+） 直刚毛（+） 灰身（+） 残 翅： 残翅（vg） 红眼（+） 直刚毛（+） 灰身（+）黑檀身： 长翅（+） 红眼（+） 直刚毛（+） 灰身（e）白 眼： 长翅（+） 白眼（w） 直刚毛（+） 灰身（+） 三隐性： 小翅（m） 白眼（w） 焦刚毛（sn） 灰身（+）4 果蝇麻醉技术:（深麻与浅麻）5 果蝇培养

12、基的制备 玉米培养基配方水琼脂蔗糖玉米粉酵母汁丙酸75ml1.5g13.5g10g1勺0.5ml6 果蝇杂交实验步骤 1）选杂交用的亲本果蝇：用作母本的雌果蝇一定要是处女蝇； 2）在25培养7天后，倒去亲本果蝇，等待F1的羽化； 3）培养14天，观察记录F1果蝇的性状，制备新培基，将F1转入新培养基中，让其自交； 4）实验第21天，倒掉F1，等待F2果蝇的羽化； 5）实验第28天，观测统计F2的类型和数目,对实验结果进行c2检验, 判断结果是否符合遗传规律。实验五 果蝇唾腺染色体的制片与观察(一) 实验原理 唾腺染色体是存在于双翅目昆虫唾腺细胞内的一种巨型染色体。它是DNA经多次复制（500-

13、1000）而不分开所形成的。因此，又叫多线染色体。它在细胞学上有四大特点：1 大；2 同源染色体紧密配对；3 具有染色中心；4 具着色深浅不同、宽窄不同的横纹。四对染色体共有5000多条带纹。每条染色体的横纹是恒定的，是识别染色体的重要标记，是进行细胞遗传学研究的极好材料。染色体的四在结构变异都是通过唾腺染色体发现的。(二) 实验目的 1 学习观察唾腺染色体的制片方法；2 观察唾腺染色体的结构特点和在细胞遗传学研究中的重要意义。(三) 实验材料 果蝇三龄幼虫（培养基中多放酵母，在17-20培养）(四) 实验器具与试剂 1 实验器具 显微镜、载玻片、盖玻片、解剖针、吸水纸、擦镜纸。 2 试剂 甘

14、油蛋白、0.7%生理盐水、1N HCl、蒸馏水、苯酚品红（P208）、无水乙醇、Eupara（牛派胶）(五) 实验步骤 1 滴甘油蛋白涂片； 2 取唾腺：选一条大且活动的三龄幼虫于载片的中央，滴一滴生理盐水，两手条握一枚解剖针，一枚按住幼虫前1/3处固定不动，一枚按住幼虫头部用力向前拉，唾腺随之而出。然后根据半透明、囊状认识唾腺，除去杂质。3 1NHCL处理唾腺2-3分钟（使组织松散,便于压片）后,用蒸馏水冲洗两次；4 用苯酚品红染色10-15分钟；5 压片：垂直用力，切勿搓动盖片；(六) 镜检观察并绘制唾腺染色体图（附果蝇唾腺染色体）实验六 小鼠骨髓细胞染色体制片与观测(一) 实验原理 在骨

15、髓细胞中，有丝分裂的指数是很高的。因此，可以直接得到中期细胞而不必像淋巴细胞或其它组织细胞那样经过无菌培养。主要的中期相来自成红细胞，也来自自各种骨髓母细胞。通过骨髓得到染色体无需无菌操作。采用直接法从骨髓中取出细胞，经滴片、空气干燥，可以得到较好的染色体标本片，供细胞遗传分析用。(二) 实验目的 1 学习用骨髓细胞制备动物染色体标本片； 2 观察小鼠染色体的形态结构和雌雄间的染色体差异(三) 实验材料 65-90天龄的年青小白鼠(四) 实验器具与试剂 1 器具 2ml注射器、5号针头、5ml离心管、吸管、试管架、载片、离心机、显微镜、剪刀、镊子、量筒、烧杯2 试剂 100微克/ml的秋水仙素

16、液、2%柠檬酸钠、0.075KCl、冰醋酸、甲醇、Giemsa原液、0.01M磷酸缓冲液(PH6.8)(五) 实验步骤 1 秋水仙素处理：取骨髓前4小时先给小鼠经腹腔注射秋水仙素0.8ml。2 取骨髓：用断髓法迅速处死小鼠，用解剖剪剪掉大腿上的皮肤和肌肉，取出完整股骨，用2%柠檬酸钠洗干净，剪掉股骨两端膨大的关节头，露出骨髓腔。用吸有适量柠檬酸钠液的注射器从股骨的一端插入注射针头，将骨髓吹入离心管，反复吹洗数次，直至股骨变白为止。离心管中的细胞悬液可达4.5ml。3 低渗处理 将所获细胞悬液经1000rpm离心10分钟,吸去上清液,加入0.075MKCl 4.5ml, 立即将细胞团吹散打匀,在

17、室温下静止25分钟。 4 固定 低渗处理后的细胞经1000rpm离心10分钟，吸去上清液，沿管壁加4.5ml 3:1的甲醇冰醋酸固定液,立即吹散细胞团,使其在固定液中悬浮均匀。静止固定30分钟后离心,去上清液,重复固定一次。当第二次固定后离心,去上清液,再加入1:1甲醇冰醋酸固定液进行第三次固定,20分钟后,离心去上清液,然后加入1:1甲醇冰醋酸2-3滴,摇匀制成细胞悬液.5 滴片 取事先在冰水中预冷的载片,滴一滴细胞悬液于粘有冰水的载片上,立即吹散细胞,将染色体装片自然干燥.6 染色 将染色体装片反扣在染色板上,用5%Giemsa染色液进行扣染20分钟,(六) 观察小鼠染色体的特征,并绘制染

18、色体图 附小鼠染色体图片 小鼠染色体实验七 动物染色体分化染色技术(C-带)(一) 实验原理 C-带是最简单的一种带。70年代用原位杂交的方法证明,C-带区是结构异染色质区。染色体标本经酸处理,使DNA脱嘌呤。碱处理产生一个高水平的DNA变性，促进DNA溶解。用2XSSC盐溶液处理使DNA骨架断裂并使断片溶解。而异染色质区DNA对抽提有较大的抗性，保留了部分DNA，用Giemsa染色出现深染带。(二) 实验目的 学习C-带分带技术和显带原理。(三) 实验材料 小鼠染色体标本片(四) 实验器具及试剂 1 实验器具 烧杯、量筒、恒温水浴箱、卧式染缸、显微镜、香柏油、擦镜纸 2 试剂 0.2MHCl

19、,5%Ba(OH)2, 2XSSC盐溶液，Giemsa原液、0.01M磷酸缓冲液(PH6.8)五 实验步骤 1 酸处理 取5-7天龄的染色体标本片,在0.2MHCl溶液中处理15-20分钟,蒸馏水冲洗;2 碱处理 将标本片放入染缸中,然后加入预热到50饱和Ba(OH)2溶液,处理10分钟后,用50的自来水染缸中的Ba(OH)2充分冲洗;3 盐处理 将标本片放入2XSSC的盐溶液中,在60温浴30分钟.4 染色 用10%Giemsa染液扣染10分钟,用自来水轻轻冲洗，自然干燥。5 镜检观察并绘制染色体C-带图实验八 植物基因组DNA的提取(一) 实验原理 DNA的提取是为了得到DNA的样品,以供

20、进一步的研究用.一般用酚氯仿将组织中蛋白质等鞭它物质从DNA中分离出,从而得到DNA。DNA提取的方法依实验的材料和提出来取的目的DNA不同有所不同。如：动物组织DNA的提取、植物DNA的提取、质粒DNA的提取等。(二) 实验目的 学习植物基因组DNA的提取方法。(三) 实验材料 韭兰（Z. grandiflora var）叶片 (四) 器具与试剂 器具: 15ml离心管、玻棒或牙签 试剂：8M 脲， 0.35MNacl、 0.05MTris-HClPH 8.0，0.02MEDTA，2%蔗糖，5%酚, 10%SDS, 氯仿,异戊醇, 3M醋酸钠, TE或双蒸水溶解试剂的配制见附录I(五) 实验

21、步骤 1 取2克新鲜的叶片在液氮中研成粉末,放入15ml离心管中,加入5mlDNA提取缓冲液(8M脲,0.35MNacl,0.05M Tris-Hcl PH8.0,0.02MEDTA,2%蔗糖,5%酚),用玻棒搅匀. 2 加入1.5ml 10%SDS,倒转离心管数次,使之混匀,60保温10分钟,其间倒转离心管数次. 3 从60水浴中取出,离心分相,吸取上清液入一新的离心管中. 4 向上清液中加入等体积的氯仿: 异戊醇(42:1)混匀,离心,吸取上清液. 5 重复上次步骤,至上下相间无沉淀物. 6 向上清液中加入1/10体积的3M醋酸钠和2.5倍体积的冷乙醇或2/3体积的异丙醇,用玻棒或牙签缠出

22、DNA,室温下晾干. 7 将带有DNA的玻棒或牙签放入15ml的离心管中,加入适量的TE或双蒸水溶解,4贮存备用.实验九 随机扩增多态DNA（RAPD）技术(一) 实验原理RAPD(randon amplified polymorphicDNA)是90年代发展起来的一种检测DNA多态性分子标记的方法，由于它快速、简便，已广泛用于动植物学领域中，是检测亲源关系、群体遗传学研究，检测种群内、种群间遗传多态性、进行种、亚种或种群鉴别的有效手段，在构建遗传位点图谱和为未来研究发现变异位点上具有潜在的应用。RAPD的基本原理是：模板DNA在94解链变性后，在一定的温度下（35-37，低于40）根据碱基互

23、补的原则，单个引物退火到基因组DNA模板两条不同的位置上，在有足够的DNA聚合酶活性的条件下，dNT从引物的3端渗入,接上与模板互补的种种单核苷酸,产生一段新的互补DNA链.如果基因组DNA分子上一段距离内没有反向平行与引物相互补的位点,则扩增的产物只呈线性增加,电泳和染色难以检测到.当互补的两条链上引物结合位点在彼此可扩增的中距离内(一般为200-2000bp),通过40过循环的聚合酶链反应就可以把该区内(200-2000bp)的DNA片断实现240倍的扩增,扩增产物经电泳分离和溴化乙锭染色后可直接在紫外灯下观察和照相,得到的电泳图谱带可作为DNA指纹做多态性分析.(二) 实验目的 学习RA

24、PD扩增的原理和分法.(三) 实验材料 韭兰叶片 (四) 仪器与试剂 1 仪器: 移液管, PCR仪,小型台式离心机,旋涡混合器,电泳仪,水平电泳槽, 2 试剂: 10碱基随机引物,GC含量为50-70%; 缓冲液(10XBuffer)、Mgcl2、dNTPs(2.5Mm for each)、TapDNA聚合酶。 3 模板DNA：为得到最佳效果，模板DNA要尽可能纯，必要时可用RNase处理总DNA粗制品，提取后，乙醇沉淀，最后DNA溶于0.1XTE缓冲液中,并稀释至1-100ng/ul.(五) 实验步骤 1 反应体系（单位ul）（更大体积需要适当延长变性及退火时间）。10XBufferMg2

25、+dNTP引物模板DNA双蒸水TapDNA酶石蜡油总计42.422227.40.2(1unit)2滴40 注: a.为使加样准确,可将反应物需要Buffer、Mg2+、dNTP一次性取出混匀，再分到离心管中。 b、TapDNA酶也一次性取出所需总量与水混匀，再分成所需等份到各个离心管中，酶液可在预变性后再加入到反应体系中。 c、上述操作均在无菌台操作，严禁污染，所用一次性移液头、离心管、双蒸水、石蜡油需高温灭菌。2 反应程序 （1）94预变性4 min； （2）94变性1 min；（3）37复性1 min；（4）72 Cy延伸2 min；（5）重复2-4步骤40个循环；（6）72保温10 mi

26、n；立即于0.7%1.5%琼脂糖凝胶电泳检测或置于4冰箱. 3 电泳分离 由于琼脂糖凝胶电泳简便易行,故一般用琼脂糖凝胶电泳检测RAPD产物,溴化乙锭(EB)染色,在305nm紫外线光照下扩增产物呈现橙红色荧光. 注意: 1) EB为强致癌物质,所有操作需带上次性手套. 2) 尽量缩短点样时间,以免样品扩散. 3) 紫外线有伤害眼睛的作用,验测时应注意保护. 4 统计分析 1) 根据可重复性实验及空白对照实验确定哪些是人为变异,去伪存真,在某一位置上扩增产物“有”记为“1”，“无”记为“0”。 2）根据F=2Nxy/（Nx+Ny）计算遗传距离，其中Nxy为两样品共有带数，Nx、Ny分别为x、y

27、样品的总扩增带数。 3）根据遗传距离构建种系发生树（） 方法：spss/pc 软件包中的组内（组间）平均连锁（within/between-group average linkage）法；MEGA（molecular evolution and geneticanalysis）中的非加权组平均（UPGMA）法和最近距离（NJ）法，RAPDist软件等，其中RAPDist软件则是专为公析RAPD数据编写的。实验十 DNA的琼脂糖凝胶电泳(一) 琼脂糖凝胶电泳的特点 在分子生物学实验技术中，琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA的主要方法之一，所用的电泳槽有垂直、圆盘和水平三种，以水平槽最为常驻机

28、构用。在电场中，PH=0.8的条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。不民浓度的琼脂糖凝胶可以分离从200bp到50kb的DNA片段。在琼脂糖凝胶中加入低浓度的溴化乙锭（ethidum bromide，EB）即可在紫外线下检测出10ng的DNA条带。在使用过程中，可边电泳边观察，而且在取出后，还可以放回去继续电泳。如有必要，还可以从凝胶中回收DNA条带，供进一步实验所需。(二) 影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素 1）DNA分子的大小 在凝胶基质中，丝状双链DNA迁移速率与其碱基对数目的常用对数值呈反比，分子越大，摩擦阻力亦越大，迁移越慢。2）琼脂糖浓度一个特定大小的DNA片段，其迁移速

29、率在不同浓度的琼脂糖中各不相同。DNA电泳迁移速率的对数与凝胶浓度成线形关系。采用不同浓度的琼脂糖凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子（见下表）不同浓度琼脂糖凝胶的线形DNA分离范围凝胶中琼脂糖含量%（W/V）线状DNA分子的有效分离范围（kb）0.36600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.232.00.12 3) 电压 在低电压时, 线状DNA片段和迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，高分子量DNA片断的迁移率将以不同的幅度增长，因此，随电压和增加，琼脂糖凝胶上有效分离范围缩小。要使大于2kb的DNA 片段的分辨率达到最大，琼脂糖凝胶上所加电压不应

30、超过5V/cm。 4）碱基组成与电压温度 DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受到DNA的碱基组成和凝胶电泳温度的影响不明显。故在琼脂糖凝胶电泳中，不同大小DNA的片段相对迁移率在430之间不发生明显的变化，琼脂糖凝胶电泳一般在实温下进行。但浓度低于0.5%的琼脂糖凝胶和低熔点琼脂糖凝胶较为脆弱，最好在4下电泳。 5) 嵌入染料的存在 溴化乙锭用于检验员测琼脂糖中的DNA,会使线状DNA的迁移率降低15%.染料嵌入到堆积的碱基之间,并拉长线状和带切口的环状DNA,使刚性更强. 6) 离子强度的影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率.在无离子存在时(如使用蒸馏水配制凝胶)电导率最

31、小,DNA几乎不移动; 而在高离子强度的缓冲液中(如误用了10X电泳缓冲液),电导很高并明显产热,严重的会引起凝胶熔解而DNA发生变性.天然双链DNA的常驻机构用电泳缓冲液有TAE、TBE、TPE等，通常配成浓缩液，贮存于室温，用前稀释。(三) 实验目的 学习和掌握DNA的凝胶电泳的原理和方法。(四) 实验材料 韭兰叶片DNA (五) 仪器与试剂 1 仪器：稳压稳电泳仪、水平电泳槽、紫外透射仪、照相机（配有紫外和橙色滤色镜）。 2 试剂：琼脂糖、载样缓冲液 电泳缓冲液溴乙锭（EB）(六) 实验步骤1 洗净并晾干电泳装置所配备的塑料盘,用胶带将其两端开口封住,置水平工作台(最好用水平仪校正2 根

32、据朽木不槽的容积和需要配制的浓度,准确称量适当的琼脂糖,转入三角瓶中,加入需量的1X电泳缓冲液(见附录I)。三角瓶容量不可过小，一般配的胶量不能超过容量的50%。3 在三角瓶烧瓶口上松松地包上一层厚纸，置沸水浴或微波炉中将悬浮液加热到琼脂糖溶解。注意不可直接在明火上加热，在微波炉中加热时间要控制好，防止沸出。4 待琼脂糖凝胶溶液冷却至60。需要时加入溴化乙锭（用水配成10%的贮存液）至终浓度为0.5%，轻轻摇匀，防止出现气泡。5 趁热将琼脂糖凝胶溶液倒入已封好的电泳槽塑料盘中，凝胶厚度在35mm之间，插入适当的梳子。为防止封口处渗漏，可在倒胶前用一支玻璃吸管吸少量凝胶溶液均匀涂于封口上。6 待

33、凝胶完全凝固后，小心移去梳子和胶带纸，放入盛有1X电泳缓冲液的电泳槽中。注意：低溶点琼脂糖凝胶和浓度低于0.5%的琼脂糖凝胶冷却至4，并在冷室中电泳。7 向电泳槽中补足电泳缓冲液至恰好没过凝胶面约1mm。8 取适量（通常为35微升）DNA样品与23微升载样缓冲液混匀，用移液管将混合后的样品轻轻点入琼脂糖凝胶的孔中。已知分子量大小的DNA标准参照物应同时加在凝胶的左、右两侧孔内，在凝胶电泳中出现系统性畸变时，易于确定未知DNA的分子量大小。测量未知DNA分子量大小时，所有样品均需要使用相同的载体缓冲液。9 盖上电泳槽的盖，按电泳的起始端接负极，另一端接正极接通电源，DNA在这样的条件下，由负极向

34、正极电泳。打开电泳仪开关，调节电压至15V/cm（按两极距离计算）。如接线正确，则会在阳极和阴极处产生气泡（由于发生电解），数分钟后，溴酚蓝从加样孔中迁移到凝胶中。继续电泳至溴酚蓝在凝胶中迁移到适当距离。电泳过程中，溴化乙锭向阴极移动（与DNA相反），延长电泳时间会使溴化乙锭从凝胶中迁移出来，令小片段DNA难以检测，可在溴化乙锭溶液（0.5%）中染色3045分钟。10 关掉电源，打开槽盖，带一次性手套取出凝胶，置紫外透射仪上，在紫外线下检测电泳情况。11 摄影在紫外透射仪上，用照相机记录电泳结果。市售紫外灯的光源发射波长大多为302nm，溴化乙锭与DNA的复合物在这一波长下的荧光产生率远远高于

35、366nm处而略低于短波长（254nm）处。用高效的外线外光源（2500UW/cm2）、一块紫外滤色镜、一块橙色滤色镜及性能良好的镜头（=135cm）在光圈为5。6时日曝光数秒就可以摄出含有10ngDNA的条带。延长曝光时间并采用强紫外光源，可在胶片上记录到仅1ngDNA所发射的荧光。按标准方法冲洗胶卷。现国内一些实验室有较先进的凝胶成像系统，可以免去冲洗胶卷和放大照片的过程，直接在热敏打印机上打印出质量很高的照片来。附录I：常用溶液的配制：1 1M Tris：取121.1g Tris碱，溶于800ml水，用浓盐酸调PH至所需值所需 PH值： 7.4 7.6 8.9浓盐酸大约用量： 70ml

36、60ml 42ml 定容至1000ml,高压蒸气灭菌.2 0.5mM2.2H2O，溶于800ml水，置于磁力搅拌器上激烈搅拌，边搅拌边加颗粒NaOH,至PH8.0(约用20gNaOH)，分装，高压蒸气灭菌。3 5M Nacl：取 292.2gNacl，溶于800ml水，定容至1000ml，分装，高压蒸气灭菌。4 3M NaAc（PH5.2）：取408gNaAc.3H2O，溶于800ml水，定容至1000ml，分装，高压蒸气灭菌。5 10%SDS: BC 100g电泳纯SDS(十二烷基磺酸钠)， 溶于900ml水，置68加热助溶,滴加浓盐酸至PH7.2,定容至1000ml，分装。6 10mg/ml溴化乙锭（EB）：取1Geb，悬于100ml水，置于磁力搅拌器上搅拌数小时以完全溶解，置暗色棕色瓶或包裹铝箔的瓶中在4储存。7 TE溶液：PH7.4: 10mM Tris.(PH7.4),1mM EDTA(PH8.0)PH7.6: 10mM Tris.(PH7.6),1mM EDTA(PH8.0) PH8.0: 1