透质细胞毒性

1、食品与药品FoodandDrug2006年第8卷第O2A期31 ? 论着? 医用透明质酸钠的细胞毒性实验 王昕,朱雪涛,施燕平 (国家药品食品监督管理局济南医疗器械产品质量监督检验中心,山东济南250013) 摘要:目的研究医用透明质酸钠的细胞毒性.方法遵照ISO10993医疗器械生物学评价国际标准的实验原则,采用 国际标准的两种实验方法,更全面地反应医用透明质酸钠的细胞毒性.结果医用透明质酸钠为0级反应阴性和阳性 对照组的反应符合规定.结论医用透明质酸钠无细胞毒性. 关键词:医用透明质酸钠;细胞毒性t浸提液 中图分类号:R969文献标识码:A文章编号:1672979X(2006)一02003

2、1-03Experimentonthecytotoxicityofmedicalsodiumhyaluronate WANGXin,ZHUXue-tao,SHIYah-ping(StateDrugandFoodAdministrationJinanQualitySupervisionandInspectionCenterforMedicalDevices, Jinan250013,China) Abstract:0bjectiveTostudythecytotoxicityofmedicalsodiumhyaluronate.MethodsAccordingtothe experimental

3、principleofinternationalbiologicalappraisingstandard(ISO10993)onmedicalapparatus,twointer nationalstandardexperimentalmethodsareadoptedonthestudyformedicalsodiumhyaluronatebywhichthe cytotoxicitycanberevealedcompletely.ResultsThemedicalsodiumhyaluronateiszerolevelwhilethenormaland modelgroupsarereas

4、onable.ConclusionThemedicalsodiumhyaluronateisnoncytotoxicity. Keywords:medicalsodiumhyaluronate;cytotoxicitytest;extractedfluid 医用透明质酸钠在医院临床和医药工业中被广 泛应用,其质量直接关系着广大人民群众的身体健 康,必须控制好其质量,进行生物学评价,使其 具有极高的生物安全性.我们使用生物学评价中首 选的体外筛选实验细胞毒性实验进行检测,它 对反映医用透明质酸钠的质量非常灵敏. 细胞毒性实验是将哺乳动物正常细胞小鼠 成纤维细胞ATCCCCLI(NCTCclone

5、929),在离体 状态下进行培养,模拟哺乳动物生物体体内生长环 境,检测医用透明质酸钠及其浸提液接触哺乳类细 胞后其生物学的反映. 1浸提液实验 1.1原理.t 使实验样品的浸提液接触受试细胞,通过对细 胞增生和抑制影响的测试,评价实验样品对细胞的 体外毒性作用.噻唑蓝(又称溴化四唑蓝,MTT) 比色法的原理是哺乳动物细胞的线粒体酶将黄绿色 的MTT降解形成蓝紫色的物质,用二甲基亚砜 (DMSO)将其溶解,用酶标仪测定其浓度,从 而定量测定细胞的存活比例.该实验用于定量评价 细胞毒性. 1.2材料与仪器 1.2.1材料医用透明质酸钠;高密度聚乙烯;天 然乳胶;MT'I'【3-(

6、4,5-dimethylthiazol一2一y1)一2,5-diphe- nyltetrazoliumbromide(进口分装);RPMIMedium1640培养基(GIBCOBRL);新生牛血清(杭 州四季青生物工程材料有限公司);胰酶(上海 源聚生物科技有限公司);0.9%氯化钠注射液 (上海通用药液有限公司);其他试剂均为国产分 析纯. 1.2.2仪器超净工作台(苏净集团安泰公司); CO.培养箱(SheldonManufacturing,Inc.);倒置 收稿日期:20050907 作者简介:王昕(1968.),女,山东龙口县人,高级工程师,研究方向为医疗器械生物学评价 32食品与药品

7、FoodandDrug2006年第8卷第02A期 光学显微镜(重庆光学仪器公司);光学显微镜 (OLYMPUS);蒸汽灭菌器(山东新华医疗器械 股份有限公司),电热恒温水浴锅(上海仪表集 团公司);96孔细胞培养板(c0Star);可调式 微量加样器(Finnpipette);酶标仪(Labsystems Drag0n). 1,3方法 1.3.1样品制备使用相同条件制备的医用透明 质酸钠(实验样品),高密度聚乙烯(阴性对照) 和天然乳胶(阳性对照)材料的浸提液. 浸提条件;浸提介质为含10%血清细胞培养 液;浸提比例为每0.2g样品加1m1浸提介质; 浸提温度为37;浸提时问为24h. 1.3

8、.2实验步骤(1)培养细胞直至其对数生长 期末细胞趋于融合,用细胞消化液消化分散细胞, 用细胞培养液配制成1X10个/ml的细胞悬液.取96孔培养板,每孔中加入100l的细胞悬浮液. 轻轻水平转动培养板使细胞均匀地分散在皿孔的表 面;(2)置含5%二氧化碳培养箱,在37±2温度 下培养24h;(3)弃去原培养液,每孔加入200IJl的 空白对照液,阴性对照液,阳性对照液,l00%浓 度的实验样品浸提液.每组至少设8孔;(4)置含 5%二氧化碳培养箱,在37±2温度下培养48h; (5)培养后,每孔加入20lMTT溶液(浓度为 5mg/m1),置含5%二氧化碳培养箱,在37&

9、#177;2 温度下培养5h;(6)弃去孔内液体,每孑L分别 加入200lDMSO,将培养板放置10rain,水平 振摇使孔内溶液颜色均匀;(7)用酶标仪测定吸光 度,采用双波长测定法,选用的波长为570nm和 630rim;(8)结果计算:细胞相对增生率RGR(%) = 实验样品组(阴性对照组,阳性对照组)的吸 光度÷空白对照组的吸光度X100%;(9)结果判 断,见表1. 表1医用透明质酸钠细胞毒性实验结果 级别反应程度显微镜下反应观察 1.4结果 空白对照组为0级反应,阴性对照组为1级反 应,阳性对照组为4级反应,实验样品浸提液为0 级反应.阴性对照组和阳性对照组的反应符合规

10、定,本实验成立. 1.5结论 实验样品即医用透明质酸钠提取液(按每O.2g 实验样品加1ml浸提介质的比例,置于37下提 取24h)表现出无细胞毒性的证据.细胞毒性为0级.医用透明质酸钠具有良好的细胞相容性,是 优良的生物材料. 2直接接触实验 2.1原理 细胞聋性检测中最严格的评价方法-直接接 触法,用于检测组织工程材料.在本实验中使用直 接接触法评价医用透明质酸钠的细胞毒性.该实验 用于定性评价细胞毒性. 2.2材料与仪器 同浸提液实验. 2.3方法 2.3.1样品制备阴性对照为已经确认的不产生细 胞毒性反应的材料高密度聚乙烯,阳性对照为经确 认的可重现细胞毒性反应的材料天然乳胶,实验样

11、品为医用透明质酸钠. 2.3.2实验步骤(1)培养细胞直至对数生长期 末细胞趋于融合,用细胞消化液消化分散细胞,用 细胞培养液配制成1X10个/ml的细胞悬液,从混 匀的细胞悬浮液中吸取2ml的悬浮液,注入6孔培 养板的每孔内.轻轻水平转动培养板使细胞均匀地 分散在皿孔的表面;(2)置含5%二氧化碳培养 箱,在37±2温度下培养24h;(3)实验前用 显微镜检查培养细胞单层的情况.弃去原培养液, 每孔加入2ml的新鲜细胞培养液.将实验样品,阴 性对照样品,阳性对照样品分别轻轻放入培养板孔 内,并使其沉于皿底,每组平行操作3孔;(4) 置含5%-氧化碳培养箱,在37±2温度下

12、培养48 h;(5)置倒置光学显微镜下观察,按表2细胞 毒性反应分级标准进行判定. 表2细胞毒性反应分级标准 2.4结果 空白对照组为0级反应,阴性对照组为l级反 应,阳性对照组为4级反应,实验样品浸提液为0 0ll_000000000.00一 食品与药品FoodandDrug2006年第8卷第02A期33 级反应.阴性对照组和阳性对照组的反应符合规 定,本实验成立. 2.5结论 实验样品即医用透明质酸钠细胞毒性为0级. 医用透明质酸钠具有良好的组织相容性,是优良的 组织工程材料. 参考文献 1】GB/T16886.122000,医疗器械生物学评价一第l2部 分:样品制备与参照样品s. 【2G

13、B/T16886.52003,医疗器械生物学评价一第5部分: 细胞毒性试验:体外法【s. 【3USPXX1124版IS.BiologicalReactivityTests./nvivo. 玻璃酸钠加bFGF促进兔膝关节全层软骨缺损修复的实验研究 康思宁,刘强 (山西医科大学第一临床医学院,山西,太原030001) 摘要:目的研究外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与玻璃酸钠关节腔内注射治疗兔膝关节全层软骨缺损的可行性 及有效性,为临床应用提供实验依据.方法相同方法制备兔膝关节软骨全层缺损模型,20只家兔共40例,随机分为 4组:(1)A组:bFGF+玻璃酸钠,(2)B组:bFGF,(3)C

14、组:玻璃酸钠,(4)D组:对照组,分别于术后第3,4,5, 6,7周注射.术后12周取材观察其大体,光镜情况,指标量化行统计学分析.结果大体观察显示:A,B组均能 修复组织较好的覆盖缺损,而C,D组较差,其组间P=0,388,没有统计学意义,除此之外任何两组间P值均小0.01, 有统计学意义.光镜观察显示:任何两组间P值均小于0.0l,有统计学意义结论外源性bFGF对兔膝关节全层软骨 缺损的修复有促细胞增生分化作用,且外源性bFGF与玻璃酸钠结合对软骨缺损修复有显着促进作用,可望临床应用. 关键词:关节软骨;缺损;玻璃酸钠;碱性成纤维细胞生长因子 中图分类号:Q538文献标识码:A文章编号:1

15、672979X(2006).02.003304 ExperimentalstudyoneffectsofsodiumhyaluronateandbFGFonrepairingfull-thickness articularcartilagedefectsoftherabbits'knees KANGSi.ning.UUQiang (TheFirstClinicaZHospitalofShanxiMedicafUniversity,Tauan030001,China) Abstract:ObjectiveTostudytheavailabilitytorepairfullthicknes

16、sarticularcartilagedefectsoftherabbits' kneeswithexogenousbasicfibroblastgrowthfactor(bFGF)andsodiumhyaluronate(SH)byintraarticular injection.MethodsPreparinganimalmodelsofful1.thicknessarticularcartilagedefectswithsamemethod.20adult rabbits(40examples)weredividedinto4groups:(1)bFGF+SH;(2)bFGF;(

17、3)SH;(4)controlgroup,then,the postoperativeintraarticularinjectionofsampledspecimensweregiveninthe3rd,4th,5th,6thand7thweek, respectively,thengavethemopticalmicroscopicalandmacroscopicalresearchin12thweek,andanalyzedthe experimentaldatawithstatisticalmethods.ResultsMacroscopicalresearch:The1stand2nd

18、groupcouldrepairthe defectsbetterthanthe3rdand4thgroup,further,the1stgroupwasbetterthanthe2ndgroup(P<0.O1).Optical microscopicalresearch:The1stgroupwasbetterthanthe2nd,3rdand4thgroup,andthePofeverytwogroups wassmallerthan0.01.ConclusionExogenousbFGFhassignificanteffectsofimprovingcellproliferationand differentiationinrepairingof