His-Tag蛋白纯化步骤

1、变性条件下从大肠杆菌中纯化多聚组氨酸标签蛋白（主要以包涵体的形式表达）的样品制备1、用 1XPBS 重悬细胞沉淀（约每毫升沉淀加 5ml1*BS）,并按上述方法进行超声破菌。2、12000rpm 离心 10min 收集包涵体。若有必要，用 1XPBS 洗包涵体几次。3、用 Binding/WashBuffer（约每毫升沉淀加 5ml1XPBS）溶解包涵体，并在室温下孵育 3060 分钟。若使沉淀充分溶解，有必要进行机械或超声均质。4、12000rpm 离心 30min,取上清至一干净管中。HisHis 标签蛋白的重力纯化流程1ml 柱子的总体积为 10ml,只需加入介质。如果样品体积大于柱子体

2、积，可重复利用，注意不要超过树脂的结合能力。1、平衡柱子的工作温度。应在室温或 4c 下进行纯化。2、取出底帽，倒出多余的液体，直立固定好柱子，让柱子顶部朝上。3、用 2 倍树脂体积的 Binding/WashBuffer 平衡柱子，以 0.51ml/min 的流速过柱。4、从柱子上部加入经 Binding/WashBuffer 处理的大肠杆菌裂解物或蛋白提取物，收集流出液。若需要，让流出液重新过柱一次，以最大限度地提高结合力。5、用两倍树脂体积的 Binding/WashBuffer 洗涤树脂并收集流出液。重复该步骤,用一新的收集管收集流出液。直到流出液的吸光度在 280nm 基线处。6、

3、用两倍树脂体积的 HutionBuffer 将 His 标签蛋白从树脂上洗脱下来。 重复此步骤两次，并单独收集每次洗脱出来的液体。7、用 ModifiedCoomassieBradfordAssayKit（NoSK3041）。洗脱的蛋白可直接进行SDS-PAGE 分析。注意：洗脱获得的蛋白可用凝胶过滤（如 NoBSP090gravityDesaltingColumn）或透析去除咪口坐以便后续应用。SDS-PAGE 分析前，含 6M 盐酸月瓜的样品必须用含 8M 尿素的缓冲液透析。就地清洗方案如果背压增加或观察到树脂明显污染，通常进行完全性能恢复流程。由于所有的 NI-IDA树脂的高螯合强度和低

4、金属浸出率，就地清洗前不需要进行 strippingo 我们建议使用下面的方法，以清除污染物，如沉淀的蛋白、疏水结合蛋白和脂蛋白。程序1、用 15 倍树脂体积的 0.5MNaOH 清洗柱子。考虑到需要 30min 的接触时间，因此需相应地调整流量（如用 0.5MNaOH 溶液以 0.5ml/min 的流速洗 1ml 的 NI-IDA 柱，需要相当于 15ml 总体积的量）。2、用 10 倍树脂体积的 1*BS 重新平衡后，树脂可马上使用。若要保存柱子，可加入 2030%乙醇或 10100mM 氢氧化钠进行 4c 保存。通过洗脱（strippingstripping）和离子重填装进行再生NI-I

5、DA 柱的洗脱（stripping）和再填装通常是没有必要的。如果背压增加或观察到树脂明显污染，就地清洗过程通常可恢复性能。但若性能仍不令人满意，柱子内的 NI-IDA树脂可用下面的程序进行洗脱（stripping）和离子重填装。程序1、用 10 倍树脂体积的洗脱缓冲液（StrippingBuffer）（50mM 磷酸钠；300mMNaCl;100mMEDTA,pH 值 8.0）洗涤树脂。2、用 20 倍树脂体积的去离子水清洗树脂。3、用 2 倍树脂体积的 100mMNiSO4（用去离子水配制）进行离子再填装。4、10 倍树脂体积的去离子水清洗，并用 10 倍树脂体积的 1XPBS 重新平衡树

6、脂，树脂可马上使用。若要保存柱子，可加入 2030%乙醇或 10100mM 氢氧化钠进行 4c保存。问题解答问题可能的原因建议样品太黏如果纯化是在 4c 进行，那改为在室温下进行。超声破菌前或超声破菌后增加细胞裂解物的稀释度。继续超声破菌，直到黏度卜降；和/或额外加入 DNAse 和流速太慢纯化过程中目2+Mg。如果用很黏稠的溶液，将柱子连接到真空管以增加流速添加去垢剂或其他物质，缓慢?!合 30min 以增加目的蛋白的可溶性。注意：TritonX-100 和 NP-40（不是 Tween）在280nm 具后高吸光度，此外，去垢剂不能通过缓冲液置的蛋白难溶或换而轻易去除。沉淀包涵体：用常规变性

7、剂如 46M 盐酸月瓜、48M 尿素或His-Tag 蛋白没强变性剂，蛋白很容易从包涵体中溶解（和去折叠）。缓慢?1 合 30min 或更长时间以助溶目的蛋白。额外增加几星升的 elutionbuffer 进行洗脱有完全被洗脱样品制备和洗样品和结合缓冲液中咪陛浓度太高，使用低浓度的咪陛。确定样品中螯合剂或强还原剂的浓度不要太高。涤过程中发现组氨酸标签可能暴露/、充分；对包涵体，可用尿素或盐流出液中存在酸月瓜对去折叠的蛋白进行纯化。减少样品的稀释，增加His-Tag 蛋白产量低His-Tag 蛋白固体尿素或盐酸月瓜。组氨酸标签丢失。检查结构的序列。His-Tag 蛋白仍然被结合。洗脱液中用高浓度的的咪陛进纯化过程中行洗脱目的蛋白沉淀在柱子中，减少样品的量；His-Tag 蛋白没洗脱过程中降低咪陛的量。尝试去垢剂或改变 NaCl 的浓后被洗脱卜来度或在变性（虫折叠）条件下洗脱。非特异性疏水或其洗脱的样品和缓冲液它互作。在洗脱缓冲液中加入非离子去垢剂或增加 NaCl 的浓度。样品和缓冲液中使用高浓度的咪陛以阻止杂蛋白结合。His-Tag 蛋中咪门坐的浓度推荐使用 2040mM,但更局浓度可能也适合。白不纯太低未结合物质洗样品制备后重复洗涤步骤以获得最佳纯度涤不充分His-Tag 蛋白被增加蛋白酶抑制剂（避免含 EDT