阿伦磷酸钠体内分析方法

1、LC-MS/MS测定血浆阿仑膦酸钠浓度方法阿仑膦酸钠不挥发，且结构中缺乏可以用紫外或者荧光检测的发光基团，因此不易直接用气相或者高效液相色谱进行定量。本文通过化学反应制备阿仑膦酸钠的衍生物，利用液质联用的方法对血浆中阿仑膦酸钠的含量进行测定。材料阿仑膦酸钠(纯度:100%),d6-阿仑膦酸钠(纯度:63%),甲醇(色谱纯),乙腈(色谱纯), 三甲基硅烷化重氮甲烷(浓度:2.0M),醋酸铵(色谱纯),甲酸(色谱纯),其它化合物为分析纯。仪器岛津(SHIMADZU) 高效液相色谱串联质谱联用仪，其中岛津 (SHIMADZU) 高效液相色谱系统，包括二元输液泵、自动进样器、柱温箱；串联质谱仪为API

2、 3200型三重四极杆串联质谱仪。色谱工作站：Analyst 1.4.2 数据处理软件 (美国AB公司)。色谱条件色谱柱：CapcellPAK-C18 column (100 mm×4.6 mm, 5 m，日本资生堂；流动相：A溶液含0.1%甲酸的乙腈溶液 ；B溶液含0.1%甲酸的10mM乙酸铵溶液。质谱条件离子源：电喷雾离子化源 (ESI 源)；离子极性：正离子 (positive)；喷射电压：4000 V；离子源温度：400 ；气体1 (GS1) 压力：50psi；气体2 (GS2) 压力：50psi；气帘气体 (N2) 压力：10 psi；碰撞气 (CAD，N2) 压力：4 p

3、si；DP 电压：60 V；碰撞能量 (CE)：30eV；CXP电压：12V；用于定量分析的离子反应对分别为质荷比 (m/z)348.2 （163+289） (A：阿仑膦酸钠) 和 m/z 354.2®（168.1+295）（B：d6-阿仑膦酸钠，内标)。标准液配制阿仑膦酸钠标准溶液的配制：用超纯水配制1.0mg/mL阿仑膦酸钠的标准储备液，取该储备液以空白血浆依次稀释，配成浓度分别为 1.00 ng/mL、3.00 ng/mL、10.0 ng/mL、30.0 ng/mL、100 ng/mL、300ng/mL、1000 ng/mL的阿仑膦酸钠标准溶液。取该储备液以空白血浆依次稀释，配

4、成浓度分别为3.00 ng/mL、30.0 ng/mL、800 ng/mL的阿仑膦酸钠质控溶液，内标d6-阿仑膦酸钠标准溶液的配制：用超纯水配制158ug/mL d6-阿仑膦酸钠的标准储备液，再用超纯水稀释d6-阿仑膦酸钠的标准储备液得到浓度为315 ng/mL的内标工作液。衍生物和样品的准备在充氮、黑暗环境中将3.0mL的三甲基硅烷化重氮甲烷加入9.75mL甲醇：水溶液（3:0.25；v/v），立即混匀后继续至于充氮、黑暗环境中。将受试者的冰冻血浆样品在室温下解冻。取100uL内标工作液加入500uL解冻血浆，然后用1.4mL水稀释。再用50uL浓度为1M的盐酸将pH调至4，漩涡振荡1min

5、。如图1所示步骤，依次加2mL甲醇、2mL的HCl（20mM）、2mL水于Waters Oasis WAX 6 cc/150 mg暗盒中。再加入振荡后的样品溶液，分别用2mL的HCl（20mM）和2mL甲醇冲洗。最后用2mL的阿仑膦酸钠衍生物溶液和1mL甲醇洗脱，收集洗脱液反应30min，然后40氮气吹干，反应如图2所示。用300uL流动相溶解产物，取20uL进样。 图1 阿仑膦酸钠衍生物制备过程 图2 阿仑膦酸钠衍生物的制备反应分析方法确证1、特异性2、标准曲线制备及定量下限的确定 标准曲线的浓度范围为1.00 ng/mL至1000ng/mL,r20.99，标准曲线为：y=（0.0233&#

6、177;0.0007）+（0.00414±0.00178）x，r2=0.9985。最低定量限为1.00 ng/mL，RSD8.8%， RE小于3.4%。3、精密度和准确度4、回收率浓度为3.00 ng/mL, 30.0 ng/mL, and 800 ng/mL 的阿仑膦酸钠溶液的回收率分别为 80.8%±6.0%,82.8%±5.2%和86.7%±5.3%。5、基质效应绝对基质效应为96.8% 97.8%,相对基质效应10.8%。说明血浆中的离子抑制或者增强作用可以忽略不计。6、稳定性 阿仑膦酸钠溶液稳定性良好，室温放置2 h (RSD2.6%; 5.4% RE 2.9%), 20 °C 储存 49天(RS