AFLP试验方法

1、模块八分子标记技术SSR技术1 .实验目的利用现代分子生物学技术揭示DNA序列的遗传多态性即建立DNA水平上的遗传标记。为分子遗传图谱的构建、遗传多样性分析与种质鉴定、重要性状基因定位与图位克隆、转基因生物鉴定、分子标记辅助育种等研究奠定实验技能基础。通过此实验了解和掌握利用SSR和AFLP分子标记检测日!物基因组DNA的遗传多态性的基本原理和实验方法。2 .实验原理SSR:根据SSR两端保守的单拷贝序列设计一对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术就可获得其长度多态性。每个SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，扩增每个位点的微卫星DNA序列，再经聚

2、丙烯酰胺凝胶电泳，比较扩增带的带型，就可检测到不同个体在某个SSR座位上的多态性。3 .实验仪器离心机、移液器(100-1000ul,10-50U1)、PCR仪、垂直板电泳设备。4 .实验试剂MgC12,引物，dNTP,10XPCR缓冲?夜,DNA聚合酶，无菌去离子水。5 .实验方法(1)将200山离心管、模板DNA、引物、dNTP、10Xbuffer、无菌去离子水和DNA聚合酶置于冰上溶解。(2)依次向无菌的200山离心管中加入如下成份，轻轻混匀，离心去除气泡。模板DNA20-60ngMgCl215-40nmol引物(各)2-8pmoldNTP1-5nmolPCR缓冲液1XDNA聚合酶1-5

3、UTotal20L(3)将离心管置于PCR仪中，按照以下程序进行PCR反应。94C2min94C50sec150-65C30sec>35循环72C90secj72C7min4Coo(4)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：利用聚丙烯酰胺凝胶检测SSR-PCR结果。SSR-PCR扩增产物可能仅仅存在几个碱基的差异，通常采用聚丙烯酰胺凝胶(银染体系)电泳方法检测。相对于琼脂糖凝胶电泳而言，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够更好的区分微小片断的差异，能够检出的等位基因位点多，多态性信息含量值较高，因此适用于SSR标记的结果检测。两种银染检测体系是在聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后，用固定剂将核酸固定到凝胶上，使银染剂中的银离

4、子与核酸牢固结合，再通过还原剂将银离子还原而发生显色反应。6 .实验结果SSR-PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳结果7 .注意事项由于SSR技术是基于PCR的一种分子标记，所以模板DNA、DNA聚合酶、dNTP以及Mg2+的浓度等因素会影响SSR的结果。如果参与反应的某些因子条件不适合，则会导致图谱弥散状背景的产生，扩增产物的消失以及电泳谱带位置的改变。改进反应条件的措施主要有：(1)保证DNA模板的质量。DNA模板的质量直接影响到PCR的效果，要求模板中的蛋白质、糖及其它杂质含量低。(2)不同引物的退火温度应根据引物的Tm略有变动。(3)设置模板DNA、DNA聚合酶、dNTP以及Mg2+的浓度梯度。

5、AFLP技术1 .实验目的学习和掌握AFLP分子标技术的原理、操作方法和实验注意事项，了解AFLP分子标记技术在分子辅助育种中的应用。2 .实验原理基因组DNA用两种限制性内切酶进行双酶切，形成分子量大小不等的限制性酶切片段，然后把酶切片段与有共同粘性末端的人工接头连接，连接后的粘性末端序列和接头序列作为PCR反应引物的结合位点，通过PCR反应对酶切片段进行预扩增和选择性扩增。由于限制性片段太多，全部扩增则产物难以在胶上分开，为此在引物的3'端加入1-3个选择性碱基，这样只有那些能与选择性碱基配对的片段才能与引物结合，成为模板被扩增，从而达到对限制性片段进行选择扩增的目的；最后通过聚丙

6、烯酰胺凝胶电泳，将这些特异性的扩增产物分离开来。3 .仪器设备离心机，培养箱，微量移液器，制冰机，离心机，PCR仪。4 .实验试剂：MseI,EcoRI,10X酶切缓冲液，MseI接头，EcoRI接头，T4-连接酶，MseI引物，EcoRI弓I物，dNTP,10XPCR缓冲?夜,DNA聚合酶。MseI引物II,EcoRI引物II,dNTP,无菌去离子水。5 .实验方法(1)接头的设计AFLP接头是双链的寡核甘酸，其设计遵循随机引物的设计原则，可采用primerpremier5.0软件设计。人工接头5'端去磷酸化，这样接头只有一端可以被连接到酶切片段的末端。AFLP接头一般由二部分组成：

7、即核心序列和限制性内切酶识别序列。通常采用EcoRI和MseI两个限制性内切酶进行酶切操作，设计的EcoRI接头和MseI接头如下表所示。EcoRI-接头MseI-接头5，/CTCGTAGACTGCGTACCGACGATGAGTCCTGAG5-CATCTGACGCATGGTAA5'TACTCAGGACTCT-5'AFLP接头构成示意图(2)引物的设计AFLP引物的设计主要由接头的设计决定，其长度一般为16-20个碱基，AFLP引物的5'端是与接头序列相对应的。AFLP引物的一个重要特征是所有引物起始于5-G残基。值得注意的是，无论5'端是何种碱基，dNTP浓度过

8、低时容易产生双链结构。3'端选择性碱基一般不超过3个*6,当引物带有1-2个选择性碱基时，引物的选择较好；当选择性碱基增加到3个时，引物的选择特异性仍可接受；当引物的选择性碱基增加到4个时，引物与模板的错配率增加，扩增特异性下降，会出现原指纹图谱中未出现的条带。对于双酶切反应而言，引物组合数共有(2n)种，n为选择碱基的数目。引物主要由3部分组成即5'端核心序列、酶切位点序列、3'端选择性延伸序列(以EcoRI弓I物和MseI引物为例，下同)。AFLP接头构成引物名称5'端核心序列酶切位点序列选择性延伸序列EcoRI引物5-GACTGCGTACCAATTCNNN

9、-3MseI引物5-GATGAGTCCTGAGiTAANNN-3(3)基因组DNA酶切为了便于灵活的调节扩增片段的大小，一般采用两种限制性内切酶消化基因组DNA。一种是切点少的内切酶，如具有6碱基识别位点的EcoRI,它产生较大的DNA片段；一种是切点多的内切酶，如具有4碱基识别位点的MseI,它产生较小的DNA片段。由EcoRI和MseI酶切产生三种基因组片断，MseI-MseI片段，EcoRI-EcoRI片段，EcoRI-MseI,其中EcoRI-MseI为主要酶切产物。将200I离心管、模板DNA、MseI、EcoRI、10buffer、无菌去离子水置于冰上溶解。20L。轻轻混匀，离心去

10、除气泡。组分DNA模板MseIEcoRI10XBufferMS100ng2U2U2人依次向无菌的200人离心管中加入各成份，加水至终体积为37C恒温培养箱酶切2-4hr。(4)接头的连接将MseI接头、EcoRI接头、T4-连接酶和无菌去离子水置于冰上溶解。依次向无菌的200山离心管中加入如下成份，加水至终体积为20山。轻轻混匀，离心去除气泡。组分酶切液EcoRI接头MseI接头T4-连接酶MS10山50pmol50pmol6U37C恒温连接16hr。(5) DNA样品的预扩增DNA样品预扩增是为了充分利用连接产物，同时获得较多扩增产物，为进一步筛选扩增引物提供保障。预扩增引物在设计时选择性碱

11、基通常为一个。 将MseI引物I、EcoRI引物I、10XPCR缓冲?夜、dNTP、DNA聚合酶和无菌去离子水置于冰上溶解。 依次向无菌的200人离心管中加入如下成份，加水至终体积为50山。轻轻混匀，离心去除气泡。连接后样品5人引物(各)10ngdNTP10nmolPCR缓冲液1XDNA聚合酶2.5U按照如下程序进行PCR反应。94C2-5min94C30sec56c60sec72c60sec72c7min4coo35循环琼脂糖凝胶电泳检测：取20I预扩增产物和5L上样缓冲液混合后在0.8%琼脂糖凝胶中检测预扩增的效果，样品用0.1XTE稀释20倍，-20C保存。(6) DNA样品的扩增预扩增

12、产物需稀释到一定倍数才能进行选择性扩增，否则会产生类似“smea的现象，具体的稀释倍数视预扩增结果而定。 将10XPCR缓冲?夜、MseI引物II、EcoRI引物II、dNTP、DNA聚合酶和无菌去离子水置于冰上溶解。 依次向无菌的200人离心管中加入如下成份，加水至终体积为20山。轻轻混匀，离心去除气泡。稀释的预扩增产物5山引物各25ngdNTP4nmolPCR缓冲液1XDNA聚合酶1U按照如下反应条件进行PCR反应。94C2min94C65C72C30sec30sec60sec”12循环，退火温度每循环降低0.7C94C30sec156C30sec卜23循环72C60sec变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增结果。6 .注意事项(1)基因组DNA应具有较好的纯度。(2)内切酶的选择应慎重。(3)要确定适宜的酶切时间，酶切时间太长浪费时间，酶切时间太短则PCR产物大片段较多、带型密集、不易分辨。必须保证基因组DNA酶切完全，否则会影响最终实验结果。(4)制作聚丙烯酰胺凝胶时，胶平板应格外清洁，否则残留去污剂会导致银染时产生褐色背