应用多重PCR方法鉴定RHD基因型的研究

1、应用多重PCR方法鉴定RHD基因型的研究 11-01-05 11:42:00 编辑：studa20作者：徐华，叶世辉，王宝燕，刘孟黎，吴大洲，贺晨【摘要】 目的建立一种可靠的PCR方法，用于RHD血型基因型的研究。方法根据RHD血型基因的特点，设计针对不同RHD基因型的特异性引物，建立多重PCR方法，并与商用试剂盒进行对比。结果本研究所建立的用于鉴定RHD血型基因型的多重PCR方法，与商用试剂盒具有相同的试验结果。结论本研究建立的多重PCR方法具有简便、准确和经济的特点，可以用于RHD基因分型。 【关键词】 多重PCR;RHD血型基因型;RHD基因分型;DEL血型ABSTRACT: Objec

2、tiveTo establish a reliable PCR method for RHD genotypes research.MethodsBased on the characteristics of RHD gene, the specific primers were designed for different RHD genotypes to establish the multiplex PCR and compare it with commercially supplied RHD genotyping kit.ResultsThe multiplex PCR utili

3、zed for RHD genotypes was established. The results of RHD genotypes were the same between the multiplex PCR method and commercially supplied kit.ConclusionThe method of the multiplex PCR can be utilized for the study of RHD genotypes because it is convenient, accurate and economical.KEY WORDS: multi

4、plex PCR; RHD genotype; RHD genotyping; DEL blood group近年来，研究发现一些血清学初检RHD阴性的个体经过进一步的检验，可以检出D抗原和D基因。通过进一步的研究，又可以分为部分D(partrial-D)和弱表现型D(weak-D)两种类型;这些特殊RHD血型的发现，对更加科学地指导安全输血工作和新生儿溶血病的实验诊断，都有非常重要的意义1。目前， RHD血型的鉴定主要依赖于血清学实验。但是，血清学的方法很难检出一些特殊的RHD血型;应用分子生物学的方法鉴定RHD血型具有鉴定准确，可以发现一些特殊的RHD血型，但市售RHD基因分型试剂盒存在价

5、格昂贵、操作复杂等缺点。为了提供一种经济、简便和直观的分子生物学方法，我们开展了多重PCR方法鉴定RHD血型基因型的研究。1材料与方法1.1材料DNA标本取自西安市无偿献血者EDTA抗凝全血样本，经血检科初步筛选分为RhD阳性和RhD阴性，用Promega全血DNA提取试剂盒提取基因组DNA，DNA浓度为50150mg/L，-20冻存备用;标准质控对照为德国INNO-TRAIN公司出品，分别为D/d型和d/d型样本。1.2多重PCR的引物设计多重PCR引物是利用人类不同的RHD基因型的特异性序列位点的改变，设计多对引物，其中引物对的DEL-f1和DEL-r1分别为特异性扩增位于第9外显子的DE

6、L基因的上下游引物，DEL-f1最末碱基针对DEL血型1227位发生GA的突变而设计2-3，DEL-r1位于第9、10外显子之间的内含子中，扩增片断长度为102bp;引物对的Dc-f1和Dc-r1分别为扩增位于RHD和RHCE基因第8外显子的上下游引物，作为内对照使用，扩增片断长度为206bp;引物对的RhD-f1和RhD-r1分别为特异性扩增位于第10外显子的RHD基因的上下游引物，其中RhD-f1位于第9、10外显子之间的内含子中，无序列特异性，RhD-r1位于RHD基因第10外显子中，与同位置RHCE基因有11个碱基差异，具有序列特异性，扩增片断长度为261bp;引物对的Dneg-f1和

7、Dneg-r1分别为特异性扩增杂合的Rh盒子基因的上下游引物，其中Dneg-f1位于上游Rh盒子基因内，在下游Rh盒子基因无相同序列，Dneg-r1位于下游Rh盒子基因内，在上游Rh盒子基因无相同序列，扩增片断长度为1921bp(图1、表1)。图1RHD基因型检测引物设计原理图Fig.1 The principle of primer designing for RHD genotyping表1RHD基因型检测引物序列1.3PCR反应条件PCR仪为PE 9700(美国，AB公司);Taq酶购自上海PROMEGA公司;dNTP购自北京鼎国生物技术有限公司;在100L的Ependoff管内加入12

8、.8L PCR缓冲液、2.0L引物混合物、2.0L dNTP混合物、0.2L Taq DNA聚合酶和3.0L模板DNA，总体系为20L，充分混合;PCR反应条件为：94变性5min，然后进行35个循环的PCR反应(94 40s，56 40s和72 2min)，随后72延伸5min，4保存;40g/L琼脂糖凝胶电泳(200V，20min)，紫外灯下观察结果并拍照。1.4验证本方法的准确性对照的RHD基因检测试剂盒分别购自德国INNO-TRAIN公司和天津市秀鹏生物技术开发有限公司，按照试剂盒的实验方法进行操作，以结果的格局图来判断结果。 11-01-05 11:42:00 编辑：studa202

9、结果2.1多重PCR方法的反应结果应用多重PCR方法可以鉴定不同的RHD基因型(图2)。根据扩增条带判断结果，D/d型：目标条带为3条，分别为208bp、263bp和1920bp;d/d型：目标条带为2条，分别为208bp和1920bp;D/D型：目标条带为2条，分别为208bp和263bp;DEL/d：目标条带为4条，分别为102bp、208bp、263bp和1920bp;由图2可知，本实验室所建立的实验方法，具有简便直观，鉴定准确的特点，可以检测出人类RHD基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型，适于大样本量的筛选和检测。图2多重PCR方法检测RHD基因型的电泳图Fi

10、g.2 Electrophoretogram of RHD genotypes by the multiplex PCRM：Marker(DL2000)，购自TaKaRa公司;1、2：INNO-TRAIN公司的标准物，1为D/d型，2为d/d型;3：D/D型;4：D/d型;5：DEL/d型;6：d/d型;7：DEL/d型;8为d/d型。2.2本方法与商用试剂盒的对照结果应用德国INNO-TRAIN公司和天津市秀鹏生物技术开发有限公司RHD基因检测方法进行相同样本的基因分型(图3、图4)，按照条带布局判断结果，检测结果与本实验室的方法结果相符。与商用试剂盒相比，自建方法只需要在凝胶中加1孔的反应

11、产物电泳后即可判断结果，而商用试剂盒需要8孔通过格局来判断结果，自建方法明显较为简便。图3INNO-TRAIN公司试剂盒RHD基因分型的电泳图Fig.3 Electrophoretogram of RHD genotypes by commercially supplied kit from INNO-TRAIN CompanyA、C：购自INNO-TRAIN公司的标准物;A：D/d型;B：D/D型;C：d/d型;D：d/d型;E、F：DEL/d型。2.3应用本方法检测Rh阴性无偿献血者基因型的结果共筛选了437例西安市Rh阴性无偿献血者的基因型，检出DEL/d基因型88例，占Rh阴性无偿献血

12、者20%，无效D基因型(即有D基因但不表达D抗原，基因型为D/D和D/d)33例，占7.5%。采用本方法可以直观和高通量地检测Rh血型的基因型(图5)。为保证实验的准确性，避免假阴性和假阳性，在检测样本中加入已知RHD基因型的质控样本，图中C1(DEL/d型)、C2(d/d型)和C3(D/d型)即为质控样本，根据其反应结果判断实验结果是否可靠。图4天津市秀鹏公司试剂盒RHD基因分型的电泳图Fig.4 Electrophoretogram of RHD genotypes by commercially supplied kit from Tianjin Biosuper Company图5西安

13、市RhD阴性无偿献血者基因检测的电泳图Fig.5 Electrophoretogram of RHD genotypes for RhD negative donor in XianC1：DEL/d型;C2：d/d型;C3：D/d型。3讨论20世纪90年代，随着分子生物学技术的发展， 血型基因分型已广泛应用于ABO基因分型。例如胎儿、新生儿血红细胞ABO血型的鉴定4;由于RH基因的复杂性，RH基因的研究起步较晚，随着科研人员的努力，RH基因的位置和序列都已经被逐步确定下来。Rh抗原是由位于1号染色体短臂上的两个同源及紧密连锁的基因所编码，即RHD和RHCE基因，每个基因都是由10个外显子组成;

14、RHD基因编码D抗原，RHCE基因编码Cc和Ee抗原。RHD和RHCE基因的外显子与内含子有93.8%的同源性。RHD和RHCE基因分别长57295bp和57831bp，两个基因相隔约30kb，尾对尾形成排列(5RHD3-3RHCE5)，中间隔差一个功能未知的小膜蛋白1基因(SMP1基因)。RHD基因的两端存在有两个具有98.6%同源性的区域被称为Rh盒子(Rh boxes);RhD阴性的RHD基因缺失，两端的Rh boxes基因部分缺失后熔合形成单一杂合Rh盒子(Rh box-hybrid)，成为RhD阴性基因的特征5。RHD和RHCE基因的高度相似性使通过分子生物学进行基因检测的难度增加，

15、要建立准确的基因分型的方法，必须要避免相似基因造成的非特异性。因此，设计出的引物必须能够特异性地扩增出RHD基因而非RHCE基因，同时还能够对不同的RHD基因型加以区分。现已发现RhD阴性的个体中存在着一种重要的RhD的弱表现型：DEL(D-elution)型，DEL所占的比例在不同文献报告中不尽相同。国外报告在黑人和日本人中DEL比例较高，约30%50%，中国人初筛RhD阴性的人群中香港报告DEL占30%，内地占20%30%6-7。DEL血型引起了日益增加的关注主要源于两个方面：一是目前国内外对DEL血型作为RhD阴性血型对待，DEL血液仍用于供给RhD阴性患者使用。但是，国内外都有越来越多

16、的报道证实RhD阴性患者输用DEL血液后，产生了抗-D抗体或体内抗-D抗体效价升高，可能引起输血反应，成为临床输血中的不安全因素;二是DEL表达的D抗原是完整的D抗原，DEL血型的患者是否能够用D阳性血液，从而节约宝贵的RhD阴性血液资源8。以上的研究都必须对DEL血型进行准确的鉴定，同时大规模的检测也需要采用可靠、简便和经济的方法才能够进行。因此，我们建立的方法对开展进一步的研究具有实际价值。【参考文献】 1AVENT ND, REID ME. The Rh blood group system: a review J. Blood, 2000, 95(2):375-387.2SHAO CP

17、, MAAS JH, SU YQ, et al. Molecular background of Rh D-positive, D-negative, Del and weak D phenotypes in Chinese J. Vox Sang, 2002, 83(2):156-161.3WAGNER FF, FLEGEL WA. Review: the molecular basis of the Rh blood group phenotypes J. Immunohematology, 2004, 20(1):23-36.4岳亚飞，邱洪涛，赵亚娟，等. PCR-SSP法检测胎儿、新生儿ABO血型 J. 西安交通大学学报：医学版, 2003, 24(4):403-405.5WAGNER FF, FLEGEL WA. RHD gene deletion occurred in the rhesus box J. Blood, 2000, 95(12):3662-3668.6YE L, YUE DL, WO DQ, et al. Molecular bases of u